La solución de las proteínas que se analizarán primero se mezcla con SDS, un detergente aniónico que desnaturalice las estructuras terciarias secundarias y no-disulfuro-conectadas, y aplica una carga negativa a cada proteína en proporción con su Massachusetts. Sin el SDS, diversas proteínas con pesos moleculares similares emigrarían diverso debido a las diferencias en plegable, pues las diferencias en modelos plegables harían algunas proteínas mejorar ajuste a través de la matriz del gel que otras. El adición del SDS soluciona este problema, pues lineariza las proteínas para poderlas separarse terminantemente por el peso molecular (estructura primaria, o número (y talla) de aminoácidos). El SDS ata a la proteína en un coeficiente de aproximadamente 1.4 g SDS por la proteína de 1.0 g (aunque las relaciones de transformación obligatorias pueden variar a partir 1.1-2.2 de la proteína de g SDS/g), dando una masa aproximadamente uniforme: cargue la relación de transformación para la mayoría de las proteínas, para poder asumir la distancia de la migración a través del gel para ser relacionado directamente con solamente la talla de la proteína. Un tinte de seguimiento se puede agregar a la solución de la proteína para permitir que el experimentador siga el progreso de la solución de la proteína a través del gel durante el funcionamiento electroforético.
Ingredientes químicos y sus papeles
El '' gel de poliacrilamida (PAG) '' había sido conocido como media que embutía potencial para seccionar tejidos desde 1954. Dos grupos independientes Davis y Raymond emplearon el PAG en electroforesis en 1959. Posee varias características electroforético deseables que le hicieron un media versátil. El gel de poliacrilamida separa las moléculas de proteína según talla y carga. Es un gel sintetizado, termoestable, transparente, fuerte, relativamente químicamente inerte, puede ser preparado con una amplia gama de las tallas medias del poro, puede soportar los gradientes de alto voltaje, factibles a los varios procedimientos de coloración y destaining y puede ser digerido para extraer fracciones separadas o ser secado para la autoradiografía y la grabación permanente. La electroforesis del DISCO utiliza los geles de diversas tallas del poro. El DISCO conocido fue derivado de las discontinuidades en la matriz electroforética y coincidentemente de la dimensión de una variable discoide de las zonas separadas de los iones (Anbalagan, 1999). Hay dos capas de gel, a saber el empilar o gel del espaciador, y resolviendo o separando el gel.
Empilar el gel
El gel que empila es un gel de poliacrilamida grande del poro (el 4%). Este gel se prepara con el almacenador intermediario pH 6.8 de Tris de cerca de 2 unidades del pH más bajo que el del almacenador intermediario de la electroforesis. ¿Estas condiciones proporcionan a un ambiente para las reacciones de Kohlrausch, consecuentemente, las proteínas se concentran a repetido y a una zona que comienza fina de la orden de 19? m se alcanza en algunos minutos. Este gel se echa sobre el gel de resolución. La altura de la región del gel que empilaba era siempre la altura más que doble mantenida y el volumen de la muestra que se aplicará.
Gel de resolución
El gel de resolución es un pequeño gel de poliacrilamida del poro (3 30%). El almacenador intermediario de Tris usado está de pH 8.8. En este gel, las moléculas macras se separan según su talla. En el actual experimento, el gel de resolución del 8%, del 10% y del 12% fue utilizado para separar diverso rango de proteínas. gel del 8% para 24 †“205 proteínas del kD, gel del 10% para 14-205 proteínas del kD y gel del 12% para 14-66 proteínas del kD
Ingredientes químicos
Tris aminomethane) (de los tris (metilo hidroxi) (C4H11NO3; mw: 121.14). Se ha utilizado como almacenador intermediario porque es una sustancia inofensiva a la mayoría de las proteínas. Su pKa es 8.3 en 20 °C y razonablemente un almacenador intermediario muy satisfactorio en el †“9.0 del rango 7.0 del pH.
Glicocola (ácido acético amino) (C2H5NO2; mw: 75.07). La glicocola se ha utilizado como la fuente de ión que se arrastraba o de ión lento porque su pKa es 9.69 y la movilidad del glycinate es tal que la movilidad eficaz se puede fijar en un valor debajo de el de las proteínas sabidas más lentas de la carga negativa neta en el rango del pH. El mínimo pH de este rango está en alguna parte alrededor 8.0.
Acrilamida (C3H5NO; mw: 71.08). Es un polvo cristalino blanco. Mientras que disuelve en agua, el autopolymerisation de la acrilamida ocurre. Es un proceso espontáneo lento por el cual las moléculas de la acrilamida ensamblan juntas por la pista en la manera de la cola. Pero en la presencia de radicales libres que generan el sistema, los monómeros de la acrilamida se activan en un estado libre-radical. Estos monómeros activados se polimerizan rápidamente y forman los polímeros con cadena larga. Esta clase de reacción se conoce como polimerización de adición delvinilo. Una solución de estos encadenamientos del polímero llega a ser viscosa pero no forma un gel, porque los encadenamientos resbalan simplemente sobre uno otro. La formación del gel requiere enganchar varios encadenamientos juntos. La acrilamida es una neurotoxina. Es también esencial salvar la acrilamida en un lugar oscuro y seco fresco para reducir el autopolymerisation y la hidrólisis.
Bisacrylamide (N, N’-Methylenebisacrylamide) (C7H10N2O2; mw: 154.17). Bisacrylamide es lo más frecuentemente el agente de conexión cruzado usado para los geles polivinílicos de la acrilamida. Químicamente se piensa en tener moléculas de la dos-acrilamida juntó comparativo en sus extremos non-reactive. Bisacrylamide fue preservado en 4 °C.
Sulfato Dodecyl de sodio (SDS) (C12H25NaO4S; mw: 288.38). El SDS es el agente de disociación más común usado para desnaturalizar las proteínas nativas a los polipéptidos individuales. Cuando una mezcla de la proteína se calienta a 100 °C en la presencia de SDS, los abrigos del detergente alrededor de la espina dorsal del polipéptido. Ata a los polipéptidos en una relación de transformación de peso constante de 1.4 g/g del polipéptido. En este proceso, las cargas intrínsecas de polipéptidos llegan a ser insignificantes cuando están comparadas a las cargas negativas contribuidas por el SDS. Así los polipéptidos después de que el tratamiento se convierta en una barra como la estructura que posee una densidad de carga uniforme, de que son la misma carga negativa neta por longitud de unidad. Las movilidades de estas proteínas serán una función linear de los logaritmos de sus pesos moleculares.
Persulfato del amonio (APS) (N2H8S2O8; mw: 228.2). Los APS son un iniciador para la formación del gel.
TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; mw: 116.21). La polimerización química del gel de la acrilamida se utiliza para SDS-PAGE. Puede ser iniciada por el persulfato y la amina cuaternario, N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) del amonio. El índice de polimerización y de las características del gel resultante depende de la concentración de APS y de TEMED. El aumento de la cantidad de APS y de TEMED da lugar a una disminución de la longitud de cadena del polímero medio, a un aumento en turbiedad del gel y a una disminución de la elasticidad del gel. La disminución de la cantidad de iniciadores muestra el efecto reverso. Las concentraciones más bajas de los catalizadores que permitirán la polimerización en el periodo de tiempo óptimo deben ser utilizadas. Los APS y TEMED se utilizan, aproximadamente en concentraciones equimolares en el radio de acción de 1 a 10 milímetros.
Productos químicos para procesar y la visualización
Los productos químicos siguientes se utilizan para procesar del gel y de las muestras de la proteína visualizados en él:
Azul del bromofenol (BPB) (3’, 3’’, 5’, 5’’-Tetrabromophenolsulphonephthalein) (C19H10Br4O5S; mw: 669.99). BPB es el tinte universal de la etiqueta de plástico. Las proteínas y los ácidos nucléicos son sobre todo descoloridos. Cuando se sujetan a la electroforesis, es importante parar el funcionamiento antes de que escurr el gel. BPB es empleado lo más comúnmente posible siguiendo el tinte, porque es viable en álcali y el pH neutral, él es una pequeña molécula, es ionizable y está negativamente - cargado sobre pH 4.6 y por lo tanto se mueve hacia el cátodo. El ser una pequeña molécula él se mueve delante de la mayoría de las proteínas y de los ácidos nucléicos. Mientras que alcanza el final anódico de la electroforesis media de la electroforesis se para. Puede atar con las proteínas débil y dar color azul.
Glicerol (C3H8O3; mw: 92.09). Es un preservativo y un agente de pesaje. La adición de glicerol (20-30 o el 50%) se recomienda a menudo para el almacenaje de enzimas. El glicerol mantiene la solución de la proteína en la temperatura muy baja, sin la congelación. También ayuda a pesar abajo la muestra en los receptores de papel sin la extensión mientras que carga.
Azul brillante de Coomassie (CBB) (C45H44N3NaO7S2; mw: 825.97). CBB es la mancha más popular de la proteína. Es un tinte aniónico, que ata con las proteínas no específico. La estructura de CBB es predominante no polar. Se utiliza tan generalmente (0.025%) en la solución metanólica (el 40%) y el ácido acético (el 7%). Las proteínas en el gel son fijadas por el ácido acético y manchadas simultáneamente. Exceso del tinte incorporado en el gel puede ser quitado destaining con la misma solución pero sin el tinte. Las proteínas se detectan como vendas azules en un fondo claro. Pues el SDS es también aniónico, puede interferir con la coloración de proceso. Por lo tanto, de gran capacidad de manchar la solución se recomienda, aproximadamente diez veces el volumen del gel.
Butanol (C4H10O; mw: 74.12). Se utiliza butanol saturada agua como una solución del recubrimiento en el gel de resolución.
Además de la adición de SDS, las proteínas se pueden calentar opcionalmente abreviadamente a la ebullición cercana en presencia de un reductor, tal como dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol/BME, que desnaturaliza más lejos las proteínas reduciendo acoplamientos del disulfuro, así superando algunas formas de plegamiento de proteína terciario, y rompiendo para arriba la estructura cuaternario de la proteína (subunidades oligoméricas). Esto se conoce como reducción de SDS-PAGE, y es la más de uso general. SDS-PAGE no reductor (ninguÌn reductor de ebullición y ninguÌn) puede ser utilizado cuando la estructura nativa es importante en análisis adicional (e.g. actividad enzimática, mostrada por el uso de zymograms). Por ejemplo, la electroforesis continua nativa preparatoria cuantitativa del gel de poliacrilamida (QPNC-PAGE) es un nuevo método para separar metalloproteins nativos en matrices biológicas complejas.
Dos SDS-PAGINACIÓN-geles después de un funcionamiento terminado
Las proteínas desnaturalizadas se aplican posteriormente a un final de una capa de gel de poliacrilamida sumergida en un almacenador intermediario conveniente. Una corriente eléctrica es aplicada a través del gel, haciendo las proteínas negatively-charged emigrar a través del gel hacia el ánodo. Dependiendo de su talla, cada proteína se moverá diferentemente a través de la matriz del gel: las proteínas cortas quieren cabido más fácilmente a través de los poros en el gel, mientras que son grandes unos tendrán más dificultad (encuentran más resistencia). Después de una cantidad del conjunto de tiempo (alguno el hoursthough esto depende generalmente del voltaje aplicado a través del gel; voltajes más altos se ejecutan más rápidamente pero tienden a producir una resolución algo más pobre), las proteínas diferenciado habrán emigrado basado en su talla; proteínas más pequeñas tendrán llanura más lejana viajada el gel, mientras que son grandes unos habrán permanecido más cercano a la punta del origen. Así las proteínas se pueden separar áspero según la talla (y por lo tanto, peso molecular). Después de electroforesis, el gel puede ser manchado (lo más comúnmente posible con la mancha azul de Coomassie o de plata brillante), permitiendo la visualización de las proteínas separadas, o ser procesado más lejos (e.g. mancha blanca /negra occidental). Después de manchar, diversas proteínas aparecerán como vendas distintas dentro del gel. Es común al funcionamiento “proteínas de la etiqueta de plástico” del peso molecular sabido en un carril separado en el gel, para calibrar el gel y determinar el peso de proteínas desconocidas comparando la distancia viajó concerniente a la etiqueta de plástico. El gel realmente se forma porque la solución de la acrilamida contiene una pequeña cantidad, generalmente cerca de 1 porción en 35 del bisacrylamide, que puede formar reticulaciones entre dos moléculas de la poliacrilamida. La relación de transformación de la acrilamida al bisacrylamide se puede variar para los propósitos especiales. La concentración de la acrilamida del gel se puede también variar, generalmente en el rango a partir de la 5% hasta el 25%. Geles más bajos del porcentaje son mejores para resolver las proteínas muy de molecularidad elevada del peso, mientras que porcentajes mucho más altos son necesarios resolver proteínas más pequeñas. Determinando cuánto de las varias soluciones se puede hacer mezclarse junta para hacer los geles de la concentración determinada de la acrilamida en línea
La electroforesis del gel es generalmente la primera opción como análisis de la pureza de la proteína debido a su confiabilidad y facilidad. La presencia de SDS y del paso de progresión de desnaturalización hace las proteínas ser separada solamente basó en talla. Las negativas falsas y los positivos son posibles. Un contaminante de la migración del co puede aparecer como la misma venda que la proteína deseada. Este comigration podía también hacer una proteína ejecutarse en una diversa posición o no poder penetrar el gel. Esta es la razón por la cual es importante manchar el gel entero incluyendo la sección que empila. El azul brillante de Coomassie también atará con menos afinidad a las glicoproteínas y a las proteínas fibrosas, que interfiere con la cuantificación (Deutscher 1990).
Sistemas del almacenador intermediario
La mayoría de las separaciones de la proteína se realizan usando un sistema “discontinuo” del almacenador intermediario que realce perceptiblemente la agudeza de las vendas dentro del gel. Durante electroforesis en un sistema discontinuo del gel, un gradiente del ion se forma en el primero tiempo de la electroforesis que hace todas las proteínas enfocarse en una sola venda sostenida. Esto ocurre en una región del gel que tiene poros más grandes de modo que la matriz del gel no retarde la migración durante la concentración o “empilar” de acontecimiento. Los iones negativos del almacenador intermediario en el tanque después “superan” la proteína SDS-cubierta “pila” y eliminan el gradiente del ion de modo que las proteínas se separen posteriormente por la acción de tamizado en el más bajo, región de “resolución” del gel.
Mucha gente continúa utilizando un sistema de la tris-glicocola o del buffering de “Laemmli” que empile y resuelva en un pH de ~8.3-9.0. Estos pHs promueven la formación del enlace de disulfuro entre los residuos de la cisteína en las proteínas, especialmente cuando están presentes en las altas concentraciones porque el pKa de la cisteína se extiende a partir de la 8-9 y porque el reductor presente en el almacenador intermediario del cargamento co-no emigra con las proteínas. Los avances recientes en tecnología del buffering alivian este problema resolviendo las proteínas en un pH bien debajo del pKa de la cisteína (e.g., bis-tris, pH 6.5) e incluyen los reductores (e.g. bisulfito del sodio) ese movimiento en el gel delante de las proteínas de mantener un ambiente de reducción. Una ventaja adicional de usar almacenadores intermediarios con pHs más bajos es que el gel de la acrilamida es más estable así que los geles se pueden salvar por largos periodos del tiempo antes de usar.
Guía a la purificación de la proteína, volumen 182
La “coloración de plata de proteínas en las membranas electroblotting y la intensificación de la coloración de plata de proteínas se separó por la bioquímica anal 2002 de la electroforesis del gel de poliacrilamida”.
“electroforesis dodecyl del gel de la sulfato-poliacrilamida del Tricine-sodio para la separación de proteínas en el rango a partir de la 1 a 100 bioquímicas anales 1987 del kDa”.
“Hendidura de proteínas estructurales durante el ensamblaje del jefe de la naturaleza 1970 del bacteriófago T4”.
