Una cartilla es un hilo del ácido nucléico, o una molécula relacionada que sirve como punto de partida para la réplica de la DNA. Una cartilla se requiere porque la mayoría de las polimerasas de DNA, las enzimas que catalizan la réplica de la DNA, no pueden comenzar a sintetizar un nuevo hilo de la DNA del rasguño, pero puede agregar solamente a un hilo existente de nucleótidos.
En la mayoría de la réplica natural de la DNA, la última cartilla para la síntesis de la DNA es un hilo corto del ARN. Este ARN es producido por una polimerasa de ARN, y más adelante quitado y substituido por la DNA por una polimerasa de DNA.
Muchas técnicas de laboratorio de la bioquímica y de la biología molecular que implican las polimerasas de DNA, tales como reacción en lasecuencia de la DNA y cadena de polimerasa (polimerización en cadena), requieren las cartillas. Las cartillas usadas para estas técnicas son generalmente moléculas cortas, químicamente sintetizadas de la DNA con una longitud cerca de veinte bases. La construcción real de tales cartillas comienza con 3 ' - nucleósidos del hidróxido (phosphoramidite) asociados a un vidrio supuesto del controlado-poro (CPG). Los 5 ' - el hidróxido de los nucleósidos es el dimethoxytrityl cubierto (DMT), que previene el edificio de un encadenamiento del nucleótido. Para agregar un nucleótido, el DMT químicamente se quita, y se agrega el nucleótido. Los 5 ' - el hidróxido del nuevo nucleótido es bloqueado por el DMT, previniendo la adición de más de un nucleótido a cada encadenamiento. Después de ese, el ciclo se relanza para cada nucleótido en la cartilla. Esto es una descripción simplificada; el proceso real es absolutamente complicado. Por esa razón, la mayoría de los laboratorios no hacen las cartillas ellos mismos, sino las piden de las compañías especializadas.
La secuencia de la DNA se utiliza para determinar los nucleótidos en un hilo de la DNA; el método de cadena del fin (secuencia del dideoxy o método de Sanger) utiliza una cartilla como etiqueta de plástico del comienzo para la reacción en cadena.
En la reacción en cadena de polimerasa, las cartillas se utilizan para determinar el fragmento de la DNA que se amplificará por el proceso de la polimerización en cadena. La longitud de cartillas no es generalmente más de 50 nucleótidos (puesto que la DNA es generalmente double-stranded, su longitud se mide en pares bajos. La longitud de la DNA de una sola fila se mide en bases o nucleótidos), y corresponden con exactamente el principio y el extremo del fragmento de la DNA que se amplificará. Destemplan (adhiérase) al modelo de la DNA en estos las puntas el comenzar y de conclusión, donde la DNA-Polimerasa ata y comienza la síntesis del nuevo hilo de la DNA.
Diseño de la cartilla
La opción de la longitud de las cartillas y de su temperatura de fusión (TM) depende de un número de consideraciones. La temperatura de fusión de una cartilla se define como la temperatura en qué 50% de esa misma especie de la molécula de la DNA forman una hélice doble estable y los otros 50% se han separado a las moléculas del solo hilo. La temperatura de fusión requirió aumentos con la longitud de la cartilla. Las cartillas que son demasiado cortas destemplarían en varias posiciones respecto a un modelo largo de la DNA, que daría lugar a copias no específicas. Por una parte, la longitud de una cartilla es limitada por la temperatura requerida para derretirla. Las temperaturas de fusión que son demasiado altas, es decir, sobre 80 °C, pueden también causar problemas puesto que la DNA-Polimerasa es menos activa en tales temperaturas. La longitud óptima de una cartilla es generalmente a partir 20 a 30 nucleótidos con una temperatura de fusión entre cerca de 55 °C y 65 °C. Hay varias maneras de calcular la temperatura de fusión de cartillas. (A, G, C y T son el número de nucleótidos en la cartilla, respectivamente. [Na+] es la concentración de Na+ en el frasco de la polimerización en cadena.)
Método de la “CROMATOGRAFÍA GASEOSA” -: Rápido y simple, para las cartillas con más de 13 nucleótidos. <math>T_ \ mbox {m} =64+41 \ cdot \ frac {G+C-16.4} {A+G+C+T} </math>
- método “Sal-ajustado”: Más exacto que CROMATOGRAFÍA GASEOSA, para las cartillas con más de 13 nucleótidos. <math>T_ \ mbox {m} =100.5+41 \ cdot \ frac {C+G} {A+C+G+T} - \ frac {820} {} \ cdot 16.6 \ cdot \ log_ {10} ([\ mbox {Na} ^+]) </math> de A+C+G+T
Base-empilar el cálculo: El más exacto, pero complicado
El <math> \ el delta H</math> es la entalpia de la base que empila las interacciones ajustadas según factores de lanzamiento de la hélice
El <math> \ el delta S</math> es la entropía de la base que empila ajustada según factores de lanzamiento de la hélice y según las contribuciones de sales a la entropía
<math>R</math> es el <math> del constante de gas universal \ se fue (\ frac {1.987 \ mbox {caloría}} {\ mbox {mol} \ ^ \ circ \ el mbox del cdot {C}} \) </math> derecho
El primou del paquete de programas informáticos libre puede calcular la temperatura del recocido según el método que empila bajo.
También, una cartilla no debe destemplar fácilmente con sí mismo u otros de su clase, bucles constructivos u horquillas en el proceso. Esto podía obstaculizar el recocido con la DNA del modelo. Sin embargo, las pequeñas horquillas son generalmente inevitables.
Se utilizan las cartillas a veces degeneradas. Éstas son realmente mezclas de similar, pero de no idéntico, cartillas. Pueden ser convenientes si se va el mismo gene a ser amplificado de diversos organismos, pues los genes ellos mismos son probablemente similares pero no idénticos. El otro uso para las cartillas degeneradas es cuando el diseño de la cartilla se basa en secuencia de la proteína. Pues varios diversos codones pueden cifrar para un aminoácido, es a menudo difícil deducir qué codón se utiliza en un caso determinado. Por lo tanto la secuencia de la cartilla que correspondía a la isoleucina delaminoácido pudo ser “ATH”, donde A representa adenina, T para el thymine, y H para la adenina, el thymine, o la citosina, según el código genético para cada codón. El uso de cartillas degeneradas puede reducir grandemente la especificidad de la amplificación de la polimerización en cadena. El problema puede ser solucionado en parte usando la polimerización en cadena del momento del aterrizaje.
Las cartillas degeneradas son ampliamente utilizadas y extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana. La tener en cuenta la amplificación de genes hasta el momento de microorganismos incultos o permite la recuperación de genes de organismos donde no está disponible la información genomic. Generalmente, las cartillas degeneradas son diseñadas alineando la secuencia del gene encontrada en GenBank. Las diferencias entre secuencias son explicadas usando los degeneracies de IUPAC para las bases individuales. Las cartillas de la polimerización en cadena entonces se sintetizan como mezcla de cartillas que corresponden a todas las permutaciones.
se utilizan las cartillas a veces degeneradas del primers=== del ===Degenerate. Éstas son realmente mezclas de similar, pero de no idéntico, cartillas. Pueden ser convenientes si se va el mismo gene a ser amplificado de diversos organismos, pues los genes ellos mismos son probablemente similares pero no idénticos. El otro uso para las cartillas degeneradas es cuando el diseño de la cartilla se basa en secuencia de la proteína. Pues varios diversos codones pueden cifrar para un aminoácido, es a menudo difícil deducir qué codón se utiliza en un caso determinado. Por lo tanto la secuencia de la cartilla que correspondía a la isoleucina delaminoácido pudo ser “ATH”, donde A representa adenina, T para el thymine, y H para la adenina, el thymine, o la citosina, según el código genético para cada codón, usando los símbolos de IUPAC para las bases degeneradas. El uso de cartillas degeneradas puede reducir grandemente la especificidad de la amplificación de la polimerización en cadena. El problema puede ser solucionado en parte usando la polimerización en cadena del momento del aterrizaje.
Las cartillas degeneradas son ampliamente utilizadas y extremadamente útiles en el campo de la ecología microbiana. Permiten la amplificación de genes hasta el momento de microorganismos incultos o permiten la recuperación de genes de organismos donde no está disponible la información genomic. Generalmente, las cartillas degeneradas son diseñadas alineando la secuencia del gene encontrada en GenBank. Las diferencias entre secuencias son explicadas usando los degeneracies de IUPAC para las bases individuales. Las cartillas de la polimerización en cadena entonces se sintetizan como mezcla de cartillas que corresponden a todas las permutaciones.
Referencias
Una versión anterior del artículo antedicho fue fijada en Nupedia.
Conexiones externas
Primer3Plus -- Diseño fácil y de gran alcance de la cartilla, basado en primer3
Cartilla 3 -- Primer3 -- Software en línea del diseño de la cartilla
Cartilla de la polimerización en cadena de FastPCR/software del diseño de la punta de prueba
