La técnica de proyección de imagen de la microscopia electrónica revela imágenes más sostenidas de la cromatina

Los investigadores de la Universidad de Illinois han desarrollado una técnica para las células de la proyección de imagen bajo un microscopio electrónico que rinde una imagen más sostenida de la estructura de la cromatina, firmemente del manojo de la herida del material genético y de proteínas que compone los cromosomas. Los resultados aparecieron en métodos de la naturaleza.

Los científicos han sabido para más que un siglo que las proteínas, tales como histonas, ayuda en la DNA del embalaje en el núcleo de una célula.  Las células humanas contienen 2 a 3 contadores de DNA, que se deben enroscar y arrollar bastantes al ajuste en de la anchura de la región un 1/10 de un pelo humano.

A pesar de el uso de las técnicas de proyección de imagen de gran alcance, de alta resolución tales como microscopia electrónica, el mecanismo al lado de el cual este embalaje de la cromatina ocurre sigue siendo un misterio.  Las fibras denso en espiral de la cromatina son muy difíciles de visualizar, y poco se sabe sobre cómo condensan durante la división de célula, o desenrolla para permitir la expresión de gene.

En desarrollar su método, el equipo de Illinois abordó una dificultad dominante en células de la proyección de imagen usando microscopia electrónica.  Los estudios tradicionales “fijan” las células con los productos químicos potentes (llamados los fijadores) para preservar su estructura para ver bajo un microscopio.  Pero los métodos estándar de la fijación interfieren con otro paso de progresión en el proceso de la proyección de imagen: el uso de anticuerpos marcados con etiqueta de etiquetar los componentes claves de las células.

Estos anticuerpos, que con etiqueta la blanco y el cierre encendido a las proteínas específicas en la célula, se pueden marcar con las escrituras de la etiqueta fluorescentes para la detección en microscopia ligera, o con las partículas del metal (oro, en este caso) para la microscopia electrónica.

“Si usted fija las células primero, usted tiene una gota dramática en la eficacia de estas reacciones inmunoquímicas,” dijo a Igor Kireev, científico que visitaba en el departamento de célula y de biología de desarrollo y autor importante del papel.  La foto del tecleo de la imagen de la microscopia electrónica para agrandar la cortesía de imagen de Andrew Belmont y de Igor Kireev la nueva técnica expone las células vivas a los anticuerpos etiquetados, un acercamiento que rinda una señal mucho más fuerte para la microscopia electrónica.

“Y si su blanco es interior la cromatina condensada, los anticuerpos no tienen ninguna manera de penetrar.”

En vez de fijar las células antes de manchar con los anticuerpos, los investigadores primero expusieron las células animales vivas a los anticuerpos etiquetados.  Esto permitió que los anticuerpos penetraran más profundamente en la estructura de la cromatina, y alzó el número de partículas del oro que se adherían a las regiones de interés.  La señal fue realzada agregando una solución de plata que precipitado (solidificado) sobre contacto con el oro.

“Estamos interesados en estructura de la cromatina, así que nuestras blancos son cromatina-limitan sobre todo las proteínas,” Kireev dijo.

Los investigadores habían insertado varias copias de una DNA bacteriana, llamadas el operador de la laca, en los cromosomas.  Una proteína bacteriana, el represor de la laca, reconoce y ata al operador de la laca en células vivas.

Los investigadores combinaron una proteína del represor de la laca con otra proteína que es fluorescente verde bajo luz azul.  Esta proteína dirigida se adhirió a los cromosomas en las regiones que contenían las secuencias del operador de la laca.  Bajo luz azul, estas regiones fueron fluorescentes.  Un anticuerpo oro-marcado con etiqueta apuntado contra la proteína fluorescente verde (GFP) entonces microinjected en el núcleo de una célula viva, que agregó una señal metálica que se podría alzar con plata.

“Todo el esto combinada nos da una señal mucho mejor, una señal mucho más fuerte, con la preservación estructural muy mejor,” Kireev dijo.

La proteína que era fluorescente ayudó a los investigadores a encontrar las regiones de interés en las células.  Estas áreas eran entonces “immunogold” etiquetado y apuntado para la microscopia electrónica.

En los micrográfos resultantes los investigadores vieron la coloración realzada de los cromosomas.

“Podemos ahora aplicar este mismo método de etiquetado de la vivir-célula al estudio en la alta resolución muchas diversas proteínas GFP-marcadas con etiqueta en el citoplasma de la célula o núcleo,” dijo a Andrew Belmont, profesor de la célula y del autor de desarrollo del biología y mayor del papel.

“En intentar entender los cromosomas, gente se ha limitado en gran parte a la visualización de la resolución baja de proteínas cromosómicas específicas usando microscopia ligera,” Belmost dijo.  “Esto significó que cada uno ha tenido que hacer mucho conjeturar de cómo las cosas se ponen juntas, llevando en muchos casos a vago, los modelos de la historieta de cuáles son probables ser estructuras cromosómicas complicadas que realizan funciones de la DNA tales como réplica y transcripción.”

“Ahora esperamos que poder mirar simplemente y ver la estructura verdadera usando más que diez veces la resolución más alta de la microscopia electrónica,” Belmont dijo.  “Nos excitan realmente para ver lo que encontraremos usando nuestro nuevo método”

• Tecnología de la imagen de la célula
• Genes identificados que controlan sino embrionario de la célula de vástago
• Técnica tridimensional de la estructura de la proteína de la microscopia electrónica cryo-EM nueva
• Respuesta de las bacterias a la tensión
• Mecanismo de la protección para hacia fuera tensionadas las bacterias