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Obteniendo alta calidad, el ARN intacto es el primer y a menudo más crítico paso de progresión de realizar muchos experimentos fundamentales de la biología molecular, incluyendo análisis norteño, análisis de la protección de la nucleasa, RT-PCR, el ARN que asocia, la traducción in vitro y la construcción de la biblioteca del cDNA. Para ser acertado, sin embargo, el procedimiento del aislamiento del ARN debe incluir algunos pasos de progresión importantes ambos antes y después de la purificación real del ARN.
Dependiendo del ARN que se extraerá, hay las características del ARN que permiten que sea aislado lejos de otros materiales celulares tales como proteínas, DNA e incluso lípidos.
El ARN de mensajero o el mRNA contiene residuos de una adenosina del estiramiento bajo la forma de polivinílico (A) cola. Esto se ha explotado para permitir que el mRNA esté limitado a polivinílico (T) las columnas o los granos de afinidad.
Si usted tiene actualmente un método preferido para aislar el ARN, continúe utilizándolo.
Si usted no ha aislado el ARN de su sistema antes de que y su organismo no esté en la lista siguiente, podemos ayudarle a identificar los protocolos establecidos que se han utilizado para aislar el ARN para borrar norteño o RT-PCR de su sistema. Estos tipos de protocolos también rendirán el ARN del “microarray-grado”.
Funcione con siempre un gel de la agarosa de su ARN para evaluar la calidad.
NOTA: Si usted utiliza no un reactivo basado columna de la purificación tal como TRIzol que le recomendamos precipitamos su ARN una segunda vez del etanol o usted lo pasa a través de una columna de Rneasy o de un dispositivo similar. Esto asegura el retiro de todos los contaminantes orgánicos (véase los espectros abajo).
El fraccionamiento nuclear/citoplásmico eficiente puede ser evaluado rápidamente desnaturalizando análisis del gel de la agarosa (véase el cuadro 1). Las vendas que corresponden al rRNA del precursor deben ser equivalentes en la fracción total y nuclear del ARN. Las vendas del rRNA 18S y 28S serán menos intensas en la fracción nuclear del ARN que en ARN del total o ARN citoplásmico de la fracción. En algunas variedades de células, por ejemplo 293 y células COS-7, esta diferencia será dramática, pero en otras líneas de las células tales como células HeLa, las vendas del rRNA son solamente levemente menos intensas en ARN nuclear que en ARN total o citoplásmico de la fracción. “
Las lecturas A260 y 260/280 de las relaciones de transformación no son bastantes para asegurar el ARN de la pureza elevada. Usted debe tomar un espectro ULTRAVIOLETA completo. Abajo están 3 espectros del ejemplo que todos tienen buen 260/280 de las relaciones de transformación, pero tienen purezas muy diversas. Usted puede también utilizar la relación de transformación de 260/230 para ayudar a determinar la cantidad de contaminación orgánica en su ARN. Es un número mucho más variable que la relación de transformación de 260/280, pero generalmente, las relaciones de transformación sobre 1 indican buena pureza.
Las células entonces fueron lavadas en PBS y sucesivamente extrajeron según lo descrito. Primero, las células fueron extraídas con el almacenador intermediario de Nonidet P-40 (10 milímetros de Tris-Cl, (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 3 milímetros de MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). La pelotilla restante (retículo endoplásmico áspero (RER) y núcleo) fue lavada en el mismo almacenador intermediario y extraída en el almacenador intermediario B (10 milímetros de Tris-Cl (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, EDTA de 40 milímetros, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). La pelotilla nuclear restante fue lavada en el mismo almacenador intermediario y extraída con el alto almacenador intermediario de la sal (10 milímetros de Tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 milímetros de MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). El ARN fue purificado de cada fracción por la solución del STAT del ARN. El ARN total fue aislado usando el reactivo RNA-STAT60 (Teléfono-prueba) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. (Referencia: Byeong-Patán Jang y otros, 2002)
Para 100 mls 200 mls
4. EDTA los 0.5M de g 106.4 el 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM del tiocianato 53.2 de los 5M Guanidinium 10 Tris-Ácido clorhídrico de los mls 25mM de los mls 20, pH 7.5 el 1M 2.5 mls 5 mls
0. b-mercaptoetanol 700ul 1.4mls del 1M
0. antiespumas A (sigma) del 2% 200 UL de la UL 400
5. volumen final del cushion* de 7 M CsCl 100 ml
5. 7 M CsCl “cocido al horno” 95.8g
0. EDTA los 0.5M del 1M 20 mls
* Utilice el agua tratada DEPC y la cristalería cocida al horno. Esta solución, absolutamente, positivamente debe ser ARNasa libremente. ¡La ARNasa está por todas partes! Desgaste los guantes, la cristalería cocida al horno del uso solamente, o el plástico virginal. Convite de DePC su agua, almacenadores intermediarios (excepto Tris). Tenga muy cuidado.
1. Pese el animal. Quite el órgano (hígado), cargue uno de los atributos superiores del cDNA es usted reducen la complejidad del gene eligiendo un órgano que exprese solamente un solo lugar geométrico de una enzima del multilocus. 2. Homogeneice el tejido rápidamente en la vuelta 3.” del almacenador intermediario del “caos (9mls) homogenant en 12 kilogramos para quitar el material insoluble 4. MIENTRAS QUE Homogenant ESTÁ HACIENDO GIRAR 4A. Pese 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) por muestra. 4B. En el tubo de la ultracentrifugadora (“rápido-sello”) agregue 3.5mls de los 5.7M CsCl “amortiguador” que esta capa debe ser ARNasa libremente. Usted centrifugará su ARN con esta capa y cualquier contaminación causará pérdidas significativas. 5. Quite supernant, puesto en el tubo fresco, agregue 1.8 g CsCl 6. cuidadosamente, agregue homogenant encima del amortiguador de CsCl. Esto es lo más fácilmente posible realizado usando una jeringuilla 10cc y una aguja larga. Coloque la aguja/la jeringuilla en el tubo del rápido-sello, y agregue el tejido homogenant a la jeringuilla. Homogenant goteará lentamente en el tubo de Q-S, flotando encima del amortiguador.
7. Cuidadosamente, pares correspondidos con del balance de tubo de centrífuga (+-0.005 g).
8. Los tubos de sello, lugar correspondieron con el contrario de los tubos de uno a y del casquillo con las tapas de aluminio rojas.
9. Centrifugadora, 50.000 rpms 5.5 horas, 20oC
Después de la centrifugación: Marque los tubos donde la pelotilla debe estar: en la cara externa inferior (concerniente al centro del rotor)
10. Quite los tubos, coloqúelos en estante conveniente.
11 Rebane de la tapa del tubo. Aspire del 2/3- superior 3/4 de la solución. TRABAJE DE LA TAPA ABAJO. ES IMPORTANTE QUE USTED ASPIRA DE LA PARTE SUPERIOR LA MAYORÍA DE LA SOLUCIÓN PRIMERO Y QUITA TODOS PERO EL AMORTIGUADOR CLARO. NO ASPIRE LA PELOTILLA INVISIBLE EN LA PARTE INFERIOR.
12. Corte el 2/3 superior del tubo. Usando un Pasteur “tirado” mida con una pipeta, quite cuidadosamente la solución restante. La pelotilla estará en la parte de abajo del tubo.
13. Aclare la pelotilla con el 70% EtOH, quítela (el uso Pasteur mide con una pipeta), reláncela dos veces (el total 3 se lava)
14. Agregue UL 200 de 0.1x TE (ARNasa libre), usando la extremidad del medir con una pipeta a la pelotilla y a “titular” del agolpamiento tentativa del T.E. de poner la pelotilla en la solución. Por lo menos forme una solución heterogénea y ponga en un tubo fresco del microfuge.
15. Relance con UL 200 del T.E. que reúne ambas soluciones
16. El vórtice, buen ARN no tiene gusto de entrar la solución. La paciencia es una virtud.
17. Determine la concentración, UL 10 en UL 490 (500 UL los vol. finales)
18. Quitan 1 a 2 ug de ARN para el análisis del gel (agregan almacenadores intermediarios del cargamento del ARN)
19. Agregan la ARNasa 3M libre NaOAC (40 UL), 2.5 volúmenes de 1/10 volumen de EtOH (1.0ml). Mezcla vigoroso.
20. Usted puede calcular la concentración de ARN en el EtOH.Thus, allí no es ninguna necesidad de precipitar todo su ARN inmediatamente. Apenas quite cerca de 1.5 a 2 veces la cantidad que usted necesita vortexing la solución de EtOH/RNA y quite el volumen apropiado. Esta solución de EtOH/RNA salvada en 20oC o baja, es estable por años.
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