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Aislamiento del RNA

Información De Fondo De la Extracción del RNA

Obteniendo alta calidad, el RNA intacto es el primer y el paso de progresión más crítico de la ejecución mucha biología molecular fundamental experimenta a menudo, incluyendo análisis norteño, análisis de la protección del nuclease, RT-PCR, el RNA que asocia, la traducción in vitro y construcción de la biblioteca de la DNA. Ser acertado, sin embargo, el procedimiento del aislamiento del RNA debe incluir algunos pasos de progresión importantes ambos antes y después la purificación real del RNA.

Métodos Básicos Del Aislamiento del RNA

Dependiendo del RNA que se extraerá, hay las características del RNA que permiten que sea aislado lejos de otros materiales celulares tales como proteínas, DNA e incluso lípidos.

El RNA o el mRNA del mensajero contiene residuos de una adenosina del estiramiento en la forma de una cola del poly(A). Esto se ha explotado para permitir que el mRNA esté limitado a las columnas o a los granos de la afinidad del poly(T).

Extremidades para la extracción y el aislamiento del RNA

Si usted tiene actualmente un método preferido para aislar el RNA, continúe utilizándolo.

Si usted no ha aislado el RNA de su sistema antes de que y su organismo no esté en la lista siguiente, podemos ayudarle a identificar los protocolos establecidos que se han utilizado para aislar el RNA para borrar norteño o RT-PCR de su sistema. Estos tipos de protocolos también rendirán el RNA del "microarray-grado".

Ejecute siempre un gel del agarose de su RNA para evaluar la calidad.

NOTA: Si usted utiliza no un reactivo basado columna de la purificación tal como TRIzol que le recomendamos precipitamos su RNA una segunda vez del etanol o usted lo pasa a través de una columna de Rneasy o de un dispositivo similar. Esto asegura el retiro de todos los contaminantes orgánicos (véase los espectros abajo).

Inhibidores del rNase usados en la extracción y el aislamiento del RNA

Controlar calidad y cantidad del aislamiento del RNA

El fraccionamiento eficiente de nuclear/cytoplasmic se puede evaluar rápidamente por análisis del gel del agarose que desnaturaliza (véase el cuadro 1). Las vendas que corresponden al rRNA del precursor deben ser equivalentes en la fracción total y nuclear del RNA. Las vendas del rRNA 18S y 28S serán menos intensas en la fracción nuclear del RNA que en RNA del total o RNA citoplásmico de la fracción. En algunas líneas de la célula, por ejemplo 293 y células COS-7, esta diferencia será dramática, pero en otras líneas de las células tales como células heLa, las vendas del rRNA son solamente levemente menos intensas en RNA nuclear que en RNA total o citoplásmico de la fracción."

Pureza del RNA

Las lecturas A260 y 260/280 de las relaciones de transformación no son bastantes para asegurar el RNA de la pureza elevada. Usted debe tomar un espectro UV completo. Debajo están 3 espectros del ejemplo que todos tienen buen 260/280 de las relaciones de transformación, pero tienen purezas muy diversas. Usted puede también utilizar la relación de transformación de 260/230 a la ayuda determina la cantidad de contaminación orgánica en su RNA. Es un número mucho más variable que la relación de transformación de 260/280, pero generalmente, las relaciones de transformación sobre 1 indican buena pureza.

Cuantificación de la extracción y del aislamiento del RNA

Aislamiento del RNA de fracciones subcelulares

Las células entonces fueron lavadas en PBS y sucesivamente extrajeron según lo descrito. Primero, las células fueron extraídas con el almacenador intermediario de Nonidet P-40 (10 milímetros de Tris-tris-Cl, (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 3 milímetros de mgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). La pelotilla restante (retículo endoplasmic áspero (RER) y núcleo) fue lavada en el mismo almacenador intermediario y extraída en el almacenador intermediario B (10 milímetros de Tris-tris-Cl (pH 7.5), 10 milímetros de NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, EDTA de 40 milímetros, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). La pelotilla nuclear restante fue lavada en el mismo almacenador intermediario y extraída con el alto almacenador intermediario de la sal (10 milímetros de Tris-tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 milímetros de mgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 milímetro DTT). El RNA fue purificado de cada fracción por la solución del STAT del RNA. El RNA total fue aislado usando el reactivo RNA-STAT60 (Tele'fono-prueba) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. (referencia: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

Aislamiento del RNA Usando El Protocolo De CsCl

Almacenador intermediario del caos para el aislamiento del RNA

Para 100 mls 200 mls

4. EDTA los 0.5M de g 106.4 el 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g los 50mM del thiocyanate 53.2 de los 5M Guanidinium 10 mls 20 mls los 25mM Tris-HCl, mls del 1M 2.5 del pH 7.5 5 mls

0. b-b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls del 1M

0. antiespuma A (sigma) del 2% 200 UL de la UL 400

5. amortiguador de 7 M CsCl * volumen final 100 ml

5. 7 M CsCl "Cocido al horno" 95.8g

0. EDTA los 0.5M del 1M 20 mls

Procedimiento De la Extracción del RNA Usando CsCl

* Utilice el agua tratada DEPC y la cristalería cocida al horno. Esta solución, absolutamente, positivamente debe ser rnase libremente. ¡El rnase está por todas partes! Desgaste los guantes, la cristalería cocida al horno del uso solamente, o el plástico virginal. Convite de DePC su agua, almacenadores intermediarios (excepto Tris). Tenga muy cuidado.

1. Pese el animal. Quite el órgano (hígado), cargue uno de los atributos superiores de la DNA es usted reducen la complejidad del gene eligiendo un órgano que exprese solamente un solo lugar geométrico de una enzima del multilocus. 2. Homogeneice el tejido fino rápidamente en el almacenador intermediario del "caos" (9mls) 3. Haga girar homogenant en 12 kilogramos para quitar el material insoluble 4. MIENTRAS QUE Homogenant ESTÁ HACIENDO GIRAR 4A. Pese 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) por muestra. 4B. En el tubo de la ultracentrifugadora ("ra'pido-sello") agregue 3.5mls de los 5.7M CsCl "amortiguador" que esta capa debe ser rnase libremente. Usted centrifugará su RNA con esta capa y cualquier contaminación causará pérdidas significativas. 5. Quite supernant, puesto en el tubo fresco, agregue 1.8 g CsCl 6. Cuidadosamente, agregue homogenant encima del amortiguador de CsCl. Esto es lo más fácilmente posible realizado usando una jeringuilla 10cc y una aguja larga. Coloque needle/syringe en el tubo del ra'pido-sello, y agregue el tejido fino homogenant a la jeringuilla. Homogenant goteará lentamente en el tubo de Q-S, flotando encima del amortiguador.

7. Cuidadosamente, el balance correspondió con pares del tubo de centrifugadora (+-0.005 g).

8. Tubos de sello, contrario correspondido con lugar de los tubos de uno a y casquillo con las tapas de aluminio rojas.

9. Centrifugadora, 50.000 rpms 5.5 horas, 20oC

Después de la centrifugación: Marque los tubos donde la pelotilla debe estar: en la cara externa inferior (concerniente al centro del rotor)

10. Quite los tubos, coloqúelos en estante conveniente.

11. Rebane de la tapa de tube.Aspirate del 2/3- superior 3/4 de la solución. TRABAJE DE LA TAPA ABAJO. ES IMPORTANTE QUE USTED ASPIRA DEL ALTO LA MAYORÍA DE LA SOLUCIÓN PRIMERO Y QUITA TODOS PERO EL AMORTIGUADOR CLARO. NO ASPIRE LA PELOTILLA INVISIBLE EN EL FONDO.

12. Corte el 2/3 superior del tubo. Con un Pasteur "tirado" mida con una pipeta, quite cuidadosamente la solución restante. La pelotilla estará en la fondo-cara del tubo.

13. Aclare la pelotilla con el 70% EtOH, quítela (el uso Pasteur mide con una pipeta), reláncela dos veces (el total 3 se lava)

14. Agregue UL 200 de 0.1x TE (rNase libre), el usar miden con una pipeta extremidad para machacar la pelotilla y la "titulación" de tentativa de T.E. de poner la pelotilla en la solución. Forme por lo menos una solución heterogénea y ponga en un tubo fresco del microfuge.

15. Relance con UL 200 de T.E. que reúne ambas soluciones

16. El vórtice, buen RNA no tiene gusto de entrar la solución. La paciencia es una virtud.

17. Determine la concentración, UL 10 en UL 490 (500 UL vol. final)

18. Quite 1 a 2 ug de RNA para el análisis del gel (agregue los almacenadores intermediarios del cargamento del RNA)

19. Agregue el rnase libremente los 3M NaOAC (de 1/10 volumen UL 40), 2.5 volúmenes de EtOH (1.0ml). Mezcla vigoroso.

20. Usted puede calcular la concentración del RNA en el EtOH.Thus, allí no es ninguna necesidad de precipitar todo su RNA inmediatamente. Apenas quite cerca de 1.5 a 2 veces la cantidad que usted necesita vortexing la solución de EtOH/RNA y quite el volumen apropiado. Esta solución de EtOH/RNA salvada en 20oC o baja, es estable por años.

Vea: