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Geles del RNA

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Historia del electrophoresis del gel del RNA

Los geles del RNA se han utilizado por décadas para separarse hacia fuera y para evaluar cualitativo la calidad del RNA aislada de muestras. Si usted no es seguro qué RNA es comprobación:

AUDIO ¡Escuche una explicación detallada del RNA! y vea nuestro artículo de la enciclopedia del RNA.

Electrophoresis Del Gel del RNA - Información De Fondo

Después del aislamiento de las muestras del RNA, la calidad de la preparación aislada del RNA es evaluada generalmente por el electrophoresis en un gel del agarose que desnaturaliza. Aunque los resultados son principalmente cualitativos, usted puede conseguir una cierta información sobre la producción del RNA también.

Desnaturalizando los geles se utilizan porque el RNA tiende para plegable sobre sí mismo y para formar la estructura secundaria extensa y estable vía emparejar bajo intramolecular. Esta estructura secundaria del RNA evita que emigre principalmente según su talla.

Cerciórese de que usted incluya un control positivo del RNA en el gel, en el caso que usted consigue resultados inusuales que usted puede entonces determinarse si el problema era con el gel o era un problema con el RNA usted está analizando. Usted puede también utilizar las etiquetas de plástico del peso molecular del RNA, una muestra del RNA sabida para ser intacto, o ambos, se pueden utilizar para este propósito.

Los geles del RNA se visualizan con el bromuro de ethidium que se mancha mientras que el bromuro de ethidium intercala entre la estructura secundaria de las moléculas del RNA y permite que el RNA sea visto bajo luz UV.

El RNA es separado hacia fuera por el electrophoresis del gel (generalmente electrophoresis del gel del agarose). Después de ejecutar un gel del RNA usted puede conducir una mancha blanca /negra norteña con transferencia subsecuente a la membrana, al hibridación con la punta de prueba, y finalmente a la detección. O simplemente (y mucho más rápido), mancha para el RNA usando el bromuro de ethidium o SYBR (o tinte similar - mejor como él es no tóxico y más seguro).

 

Aplicaciones de los geles del RNA

Pues las manchas blancas /negras norteñas son mucho más aburridas de terminar que los geles del RNA y PCR en tiempo real, no se utilizan tanto como los geles del RNA.

El electrophoresis del gel del RNA y sus variaciones se utilizan en la investigación molecular de la biología:

• detecte el RNA
• análisis para la calidad del RNA aislada
• tenga en cuenta la determinación general de la cantidad o de la producción del RNA
• análisis para la degradación del RNA

Desventajas de los geles del RNA

Las desventajas de usar electrophoresis del gel del RNA incluyen:

• Los geles del RNA no son muy cuantitativos. Usted no puede determinar exacto la producción del RNA o ascender incluso con estándares. Los métodos radiactivos tales como manchas blancas /negras norteñas el borrar o del punto son mucho más exactos.
• El bromuro de ethidium se utiliza a menudo para detectar el RNA. El bromuro de ethidium es un biohazard pues es mutágeno y tóxico.
• Los geles del RNA permiten una determinación rápida de la producción del RNA sin embargo no están tan rápidamente como el spectrophotometry UV u otros métodos.

Ventajas de los geles del RNA

Las ventajas de los geles del RNA incluyen:

• Es un método extensamente validado
• Los geles del RNA son muy rápidos y fáciles realizarse
• Usted puede probar para la calidad del RNA en el plazo de 1-2 horas
• Si usted utiliza SYBR u otra mancha no tóxica (es decir usted no utiliza el bromuro de ethidium), los geles del RNA son absolutamente seguros.

Protocolo Del Gel del RNA

Para verificar la integridad de su RNA usted debe hacer un análisisde la "mancha blanca /negra norteña ". Para lograr esto usted debe ejecutar un gel que desnaturaliza.

Para los Mini-geles a los Midi-geles del uso del RNA: Haga 50 mL-100mL

Para los Mega-geles haga 400 ml.

 

Para el gel 100mL (ejecutado lo más comúnmente posible) usted necesita agregar 1g del agarose para hacer la solución del agarose del 1%.

 

Receta corriente del almacenador intermediario para los geles del RNA

Para prepararse:	500mls	750 mls	1.5 litros
almacenador intermediario del 1X E (50X)-below	10 ml	15 ml	30 ml
formaldehído de los 0.66M (1/19 del vol.)	26.3 ml	39.5 ml	79 ml

RNA Que desnaturaliza Los Reactivo

Para preparar 400ul del RNA que desnaturaliza el reactivo:

Agregue el siguiente:

• 300ul Foramide-desionizado el 80%
• 3.7 % de la UL del formaldehído 40
• UL del almacenador intermediario 8 del 1X 50X E
• dH2O = 400ul 52ul

almacenador intermediario de 50 X E por litro

Agregue:

• 0.9 M Na2 HPO4 127.8 dibasic g
• los 0.1M NaH2PO4 g monobásico 13.8

Protocolo: Pasos de progresión en la preparación de un gel del RNA

1. ponga el agarose en soluciones.
2. Caliente la solución preparada en frasco tejido-tapado
3. Deje fresco a 60°C
4. Agregue el formaldehído al igual los 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2
5. (agregue el bromuro de ethidium si usted lo está utilizando al frasco)
6. Vierta el gel (en capilla si es posible).
7. Caliente 2 ug de RNA en 75°C por 10 min., después aprisa refresqúese (esto permitirá que el RNA desnaturalice y que permanezca solo-trenzado).
8. Agregue: 2.5 vol. del RNA que desnaturalizan el reactivo
9. Agregue 1/10 vol. del tinte del cargamento a las muestras.
10. Cargue las muestras sobre receptores de papel del gel del agarose.
11. Ejecute el gel (generalmente voltios 100V) por las horas 30minutes-2. (RNA del cheque que se ejecuta con etiquetas de plástico del tinte)

Extremidades para los geles del RNA

Ejecute siempre un gel del agarose de su RNA para evaluar la calidad. Confían no solamente solamente los resultados UV del spectrophotometry.

* Utilice el agua tratada DEPC y la cristalería cocida al horno para todos los pasos de progresión. Los almacenadores intermediarios deben ser rnase libremente o utilizar el agua purificada Milipore si usted es en acometidas. ¡El rnase está por todas partes! Desgaste los guantes, la cristalería cocida al horno del uso solamente, o el plástico virginal. Convite de DePC su agua, almacenadores intermediarios (excepto Tris). Tenga muy cuidado.

 

Geles De Localización de averías del RNA

Si usted tiene actualmente un método preferido para ejecutar el RNA, continúe utilizándolo.

Discuta y los problemas o las preguntas del poste sobre los geles del RNA en el foro de los protocolos del RNA.

Referencias Del Gel del RNA