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Mancha blanca /negra Norteña

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AUDIO ¡Escuche una explicación norteña detallada de la mancha blanca /negra!

Historia de borrar norteño

El borrar norteño es una técnica que borra del RNA que fue desarrollada en 1977 por Alwine et el al. en la universidad de Stanford (ref:1). Fue nombrado después de la técnica meridional de la mancha blanca /negra que borra para la DNA, inventada por Edwin M. Southern en 1975. La mancha blanca /negra occidental, un método para borrar para las proteínas es también un juego en la mancha blanca /negra meridional que nombra y fue nombrada en 1981 (ref:2).

Información De Fondo - Técnica Norteña De la Mancha blanca /negra

El análisis norteño a pesar de su edad en el mundo del alto tech de PCR en tiempo real, de los análisis de la protección del nuclease (RPAs) y de los microarrays, sigue siendo el oro-esta'ndar para la detección y la cuantificación de los niveles del mRNA. Esto es porque el análisis norteño de la mancha blanca /negra permite una comparación directa de la abundancia del RNA del mensajero entre las muestras en una sola membrana.

En mancha blanca /negra norteña la diferencia principal entre las otras técnicas que borran es que el RNA es el factor que es detectado. También, debido al hecho de que el RNA solo-esta' trenzado generalmente, crea las estructuras secundarias complejas que afectan su migración y por lo tanto desnaturalizando condiciones se utilizan ejecutar los geles (desemejante de meridional).

El RNA es separado hacia fuera por el electrophoresis del gel de RNA (generalmente electrophoresis del gel del agarose), la transferencia subsecuente a la membrana, el hibridación con la punta de prueba, y finalmente la detección.

 

 

Semejantemente a borrar meridional, las puntas de prueba del hibridación pueden ser DNA o RNA en borrar norteño.

Una variante del procedimiento conocido como la mancha blanca /negra norteña reversa (aunque, infrecuentemente) fue utilizada de vez en cuando. En este procedimiento, el substrato que el ácido nucleic (que se pone a la membrana) es una colección de fragmentos aislados de la DNA, y la punta de prueba es RNA extraído de un tejido fino y etiquetado radiactivo.

El uso de los microarrays de la DNA que han venido en uso extenso en los últimos años 90 y el 2000s temprano es más relacionado con el procedimiento reverso, en que implican el uso de los fragmentos aislados de la DNA puestos a un substrato, y el hibridación con una punta de prueba hecha del RNA celular. Así el procedimiento reverso, aunque originalmente infrecuente, permitido el estudio del uno-en-uno-tiempo de la expresión del gene usando análisis norteño para desarrollarse en la expresión del gene que perfila, en la cual muchos (posiblemente todos) de los genes en un organismo pueden tener su expresión vigilada

Aplicaciones de la mancha blanca /negra norteña

Las manchas blancas /negras norteñas han sido superceded en la mayoría de las áreas por PCR en tiempo real y acercamientos microarray. No se utiliza a menudo para los propósitos clínicos o de diagnóstico.

El protocolo norteño de la mancha blanca /negra y sus variaciones se utilizan sin embargo en la investigación molecular de la biología:

• un oro-esta'ndar para el estudio directo de la expresión del gene en el nivel del mRNA (transcripciones del RNA del mensajero).
• detección de la talla de la transcripción del mRNA
• degradación del RNA del estudio
• el empalmar del RNA del estudio - puede detectar transcripciones alternativomente empalmadas
• estudie el período del RNA
• IRAS del estudio (sitio ribosomal interno de la entrada) - quitar la posibilidad de digestión del RNA contra la 2da traducción del cistron.
• a menudo confirmar y controlaban los ratones transgenic/del golpe de gracia (animales)

Desventajas de borrar norteño

Las desventajas de usar borrar norteño incluyen:

• La radiactividad se utiliza a menudo. Esto previene la facilidad de realizar la, uso y la disposición. Los nuevos métodos de detección no radiactiva se han generado permitiendo la detección no radiactiva. Vea Para perforar.
• El proceso entero de borrar norteño lleva un tiempo largo generalmente, de la preparación de la muestra a través la detección.
• Si las muestras del RNA son uniformes degradadas levemente por RNases, la calidad de los datos y de la cuantificación de la expresión es absolutamente negativamente afectada.
• El método norteño estándar de la mancha blanca /negra es relativamente menos sensible que análisis de la protección del nuclease y RT-PCR. La sensibilidad de manchas blancas /negras norteñas se puede aumentar con el uso de las membranas positivo-cargadas de nylon, uso de una punta de prueba altamente específica del antisense.
• La detección con las puntas de prueba múltiples es un problema. A menudo, las membranas se deben eliminar antes del hibridación y de la detección con una segunda punta de prueba. Esto es un problema pues las condiciones ásperas se requieren para pelar puntas de prueba de la mancha blanca /negra y son también desperdiciadoras de tiempo. También, hay un límite a la cantidad de épocas que una mancha blanca /negra puede ser eliminada.

Ventajas de borrar norteño

Las ventajas de manchas blancas /negras norteñas incluyen:

• Es un método extensamente validado y bien mirado
• el borrar norteño es un método straight-forward
• Se utiliza a menudo como una confirmación o cheque
• A menudo un oro-esta'ndar
• es un protocolo versátil pues puede permitir el uso de muchos tipos de incluir de las puntas de prueba (contra PCR en tiempo real): RNA e incluso oligonucleotides transcritos radiactivos y no-radiactivos, ines vitro tales como cartillas.
• Las secuencias con incluso homología parcial, desemejante de PCR en tiempo real o de otros métodos se pueden utilizar como puntas de prueba del hibridación (es decir la secuencia de diversa especie para el análisis de la homología, o aún fragmentos genomic se puede utilizar).

Protocolo Norteño De la Mancha blanca /negra

Como mencionado los pasos de progresión en borrar norteño incluyen:

1. Aislamiento del RNA
2. Electrophoresis del gel del RNA para la separación
3. Transferencia a la membrana (el nilón generalmente positivamente cargado como RNA se carga negativamente)
4. Cross-linking del RNA a la membrana (generalmente por medios de la UV-reticulacio'n o del producto químico)
5. Hibridación
6. Detección

Materiales necesitados para el protocolo norteño de la mancha blanca /negra

Recetas Del Almacenador intermediario

20XSSPE (500 ml)

• NaCl de los 3.6M: 105.2 g
• 0. almacenador intermediario de fosfato de los 2M pH 7.0: 100mL del 1M
• EDTA de los 20mM: 20mL de los 0.5M

Almacenador intermediario de fosfato pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 140 ml (monobásicos) de 1M
• Na2H2PO4 360 ml (dibasic) de 1M
• el pH a 7.0 después de ambos se agrega

Almacenador intermediario del hibridación = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• el 2% SDS: 20 mls el 10%

 

* * Derecho antes de usar agregue el RNA desnaturalizado 1000ug de la levadura 5000ug de la DNA del rNAse libremente CT (calor a 95o por 3 minutos a desnaturalizar)

 

COLADA: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls de los mls 20X 5 el 10% SDS = 0.1% SDS

Almacenador intermediario corriente para el gel del RNA (1L)

• 100 MOPS de los mls 10X
• 52. 6 mls de formaldehído
• 847. 4 mls H20

Gel del RNA (70ml)

• 0.84 agarose de g
• 7 MOPS de los mls 10x
• 58.38 mls H2O
• Ponga el gel en la solución por la calefacción. Deje el gel fresco a 60°C, después agregue el formaldehído al igual 0.66M -- 3.78 mls
• Vierta el gel en capilla del humo si es posible

Muestras del RNA para la mancha blanca /negra norteña

Vea el aislamiento y la purificación del RNA

Gel del RNA

Después de aislar el RNA, el RNA se debe separar hacia fuera en un gel (generalmente agarose).

vea los geles del RNA

Transferencia norteña de la mancha blanca /negra al protocolo de nylon de la membrana

Después de ejecutar el gel del RNA, lave el gel con agua destilada puesta en posiblotter.

Las capas de la tapa al fondo son:

• esponja
• 3-4 corte de los papeles de Whatman a la talla (both.of.these antedichos ascendentes se deben remojar en 10X SSPE pero el no gotear)
• máscara del gel.
• Nota: Se cercioran de los recubrimientos del gel la máscara de modo que pueda sellar la membrana con la línea de la tapa del gel y la esquina superior derecha marcara 3 pedazos de un plástico duro los 3M de papel levemente más grande con los agujeros

La abrazadera encendido y se cerciora de que haya un buen sello. Utilice 75-80 milímetros hectogramo de presión para 1 hora o más.

Borre la membrana seca

Membranas De nylon Del Cross-linking - Protocolo Norteño De la Mancha blanca /negra

• Corte el abrigo superior de la esquina derecha en abrigo de saran.
• UV irradie con la cara del RNA abajo por 2.5 minutos.
• Lávese para un par de minutos en la solución caliente de 2X el SSPE/0.1% SDS (solución de la microonda por 30-45 segundos en la potencia del 50%.
• Ventile seco

Pre hibridación para la mancha blanca /negra norteña

1. Pre cruce por hibridacio'n por 6 horas-durante la noche
2. Fije el horno 65°C al almacenador intermediario del calor HB para poner el SDS en la solución
3. Ruede para arriba la membrana dentro del pedazo del acoplamiento y ponga en el hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Controle para saber si hay burbujas de aire
5. Ponga el tubo en el horno balanceado con otro tubo en cara opuesta

Punta de prueba de etiquetado para borrar norteño

1. Ponga 25ng de la punta de prueba en un volumen total de 11uL con ddH2O
2. Desnaturalice @ 95°C 3 minutos. Éste debe conseguir a la punta de prueba solo haber trenzado y quitar la estructura secundaria que prevendría el hibridación eficiente.
3. Aprisa refresqúese en el hielo mojado. Éste debe guardar solo haber trenzado de la punta de prueba, libre de la estructura secundaria y no permitir el reannealing (o el reformar de estructuras secundarias).
4. Agregue el total radiactivo (Boehringer Mannheim) 5ul de la alfa arriba primera 4ul P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
5. Incube 10-15 37°C mínimos
6. Agregue 28uL del 1X TE, EDTA de 2ul los 0.5M, a la reacción 20ul.
7. Pre-haga girar la columna de G-25 Sephadex para 1 minuto.
8. Agregue la muestra 50ul a la columna y haga girar por 2.5 minutos en centrifugadora clínica. Éste debe purificar la punta de prueba lejos de la escritura de la etiqueta.
9. Del tiro columna lejos.
10. Mézclese en un RNA nuevo de la levadura del tubo 100ug CT-DNA 50ug en un tubo 0.5mL.
11. Desnaturalice 95° 3 minutos
12. Agregue a la mezcla híbrida del tubo, cruce por hibridacio'n en 65°C por 20-36 horas

Fije el protocolo del hibridación para borrar norteño

Cruce por hibridacio'n por 36-48 horas entonces se lavan.

1. Caliente encima de calor de 2X el SSPE/0.1% SDS (colada) hasta 65° C (microonda o baño de agua del uso para calentar la solución)
2. Tome hacia fuera el tubo y vierta el líquido en el envase caliente de los desechos radioactivos.
3. La aclaración con la colada 10ml hace esto dos veces y vierte la basura hacia fuera.
4. Introducido 40 a 50 mls de colada y de sacudida vigoursly.
5. Puesto en el horno del hibridación para rotar mínimo 20.
6. Vierta abajo de fregadero
7. Otro 40-50mls y sacudida en horno.
8. Vierta hacia fuera al recipiente para residuos (fregadero si no caliente o tóxico) y cerciórese de que es un caliente no más largo y después que toma hacia fuera la membrana.
9. Lávese en la coctelera con 0.2XSSPE con 0.1% SDS en el RT por 15 minutos.
10. Ventile seco
11. Exposición

 

Extremidades para la mancha blanca /negra norteña

Si usted tiene actualmente un método preferido para aislar el RNA, continúe utilizándolo.

Ejecute siempre un gel del agarose de su RNA para evaluar la calidad. Confíe no solamente en resultados del spectrophotometry.

* Utilice el agua tratada DEPC y la cristalería cocida al horno. Esta solución, absolutamente, positivamente debe ser rnase libremente. ¡El rnase está por todas partes! Desgaste los guantes, la cristalería cocida al horno del uso solamente, o el plástico virginal. Convite de DePC su agua, almacenadores intermediarios (excepto Tris). Tenga muy cuidado.

 

Manchas blancas /negras Norteñas De Localización de averías

Si usted tiene actualmente un método preferido para aislar el RNA, continúe utilizándolo.

 

Discuta y fije las preguntas sobre esto en el foro norteño de la mancha blanca /negra.

Referencias Norteñas De la Mancha blanca /negra

1. Alwine JC, Kemp DJ, GR Rígido (1977). el "método para la detección de RNAs específico en agarose se gelifica por transferencia al diazobenzyloxymethyl-papel y el hibridación con la DNA sonda". Proc. Nacional. Acad. Sci. LOS E.E.U.U.. 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (Abril De 1981). "el ' borrar occidental ': la transferencia electrophoretic de proteínas de los geles de polyacrylamide del sulfato — dodecyl de sodio a la nitrocelulosa sin modificar y de la detección radiográfica con el anticuerpo y radioiodinated la proteína A ". Bioquímica Anal 112 (2): 195-203.