Polimerización en cadena en tiempo real

La polimerización en cadena en tiempo real es un tipo de polimerización en cadena cuantitativa que mida la cantidad de cDNA o de mRNA en una muestra, de una población de células (tejido o cultivo celular), o recientemente incluso de una célula. El tiempo real se utiliza comúnmente para determinar la expresión del mRNA de un gene, y su expresión nivela (número de copia de mRNA) durante ciertas condiciones (tales como tratar las células con una droga).  La polimerización en cadena en tiempo real se puede utilizar para comparar muestras normales (del control) a las muestras de la enfermedad, dando una idea en cuanto a los cambios de la expresión que ocurren con patogenesia.  La polimerización en cadena en tiempo real debido a su sensibilidad también se utiliza en la detección de patógeno en la sangre tal como virus.

El desarrollo de la polimerización en cadena cuantitativa en tiempo real ha eliminado la variabilidad asociada tradicionalmente a la polimerización en cadena cuantitativa, así el permitir
cuantificación rutinaria y confiable de los productos de la polimerización en cadena.

Índice

Cada tipo expressess de la célula un conjunto de moléculas del mRNA, conocido como transcriptome.  En respuesta a estímulos, las células pueden para arriba-regular o abajo-regular factores tales como enzimas de la proteína dentro de la célula regulando los niveles del mRNA de estos factores.  los niveles del mRNA no se correlacionan siempre con los niveles de la proteína así que una cierta precaución es necesaria, no obstante los niveles del mRNA corresponden generalmente libremente a los niveles de la proteína.  La medición de los niveles del mRNA de ciertos factores dentro de una célula usando la polimerización en cadena en tiempo real es un método que dará pistas en cuanto a las cantidades de estos factores o proteínas.

Tradicionalmente, los niveles del mRNA dentro de la célula fueron medidos usando borrar norteño.  Esta técnica se mira como oro-estándar en la medida de los niveles de la expresión de gene/mRNA mientras que utiliza la punta de prueba radiactiva para etiquetar el ARN, que entonces se cuantifica usando un contador de centelleo que da lecturas muy exactas. El borrar norteño aunque muy sea exacto tenía varias desventajas incluyendo el uso de la radiactividad. El borrar norteño requirió la medida exacta del mRNA y el ARN total de las células extrajo para comparar muestras. Esto era un problema porque aunque los métodos de detección fueran muy exactos, el error se podría introducir en borrar norteño (o punto del ARN/la ranura que borra) con diferencias en niveles totales de RNA/mRNA entre las muestras (tratamientos de la célula del IE, diversos tejidos, diversos animales, etc.).  También requirió relativamente las granes cantidades de ARN que requirieron una gran cantidad de células. Recientemente, la cuantificación del gene del mRNA o los métodos en tiempo real de la polimerización en cadena se ha mejorado y es más fáciles de realizarse y no requiere el uso de la radiactividad.  Los investigadores tienen a menudo solamente acceso a las pequeñas cantidades de células especialmente en los campos de la investigación de la célula de vástago y de la investigación de la célula primaria, y la polimerización en cadena en tiempo real ha permitido cuantificar niveles del mRNA incluso muy de una pequeña cantidad de células y últimamente incluso células.  Sin embargo, esta sensibilidad extrema de los métodos en tiempo real de la polimerización en cadena hace vital proteger sus muestras contra la contaminación, que llevaría a los resultados falsos. Los métodos actuales y los sistemas de la polimerización en cadena del tiempo real también no requieren la medida de las concentraciones de la muestra del mRNA o del cDNA antes de que se conduzca la polimerización en cadena en tiempo real.

Higuchi y al.1, 2 iniciaron el análisis de la cinética de la polimerización en cadena construyendo un sistema que detecta productos de la polimerización en cadena como
acumulan. Este sistema “en tiempo real” incluye el bromuro de etidio del intercalator en cada reacción de la amplificación,
un cycler termal adaptado para irradiar las muestras con la luz ultravioleta, y detección de la fluorescencia resultante
con una cámara refrescada controlada por ordenador del CCD. La amplificación produce cantidades cada vez mayores de double-stranded
DNA, que ata el bromuro de etidio, dando por resultado un aumento en fluorescencia. Trazando el aumento en fluorescencia
contra número de ciclo, el sistema produce los diagramas de la amplificación que proporcionan a un cuadro más completo del
La polimerización en cadena procesa que la acumulación de prueba del producto después de un número fijo de ciclos.