Técnicas de la identificación de la proteína

Las proteínas se pueden separar por la 2.a electroforesis del gel e identificar con espectrometría total

El contenido proteínico de una célula se estima para consistir en millares de diversos tipos de proteínas
con un rango dinámico de la expresión. La tecnología que se está utilizando actualmente implica la extracción de los componentes de proteína, fraccionamiento de esta mezcla muy compleja,
proteólisis enzimática de cada especie separada y aislada, análisis espectrométrico total extenso y finalmente corresponder con los datos estructurales generados contra una base de datos de proteínas sabidas o de productos anticipados de la expresión del genoma.
Este procedimiento implica un paso inicial usando 1 - o la electroforesis de 2 dimensiones (DE). Usando 1-DE, las proteínas se separan en base de masa molecular; la técnica es reproductiva y se puede utilizar para las proteínas en el rango total del kDa 10-300, pero ha limitado la resolución.
Para la separación de mezclas más complejas de la proteína, 2-DE es el método preferido. Esto implica el separar de las proteínas primero según su carga neta por un paso de progresión de la concentración isoeléctrica y entonces, en la segunda dimensión, según su masa molecular que emplea la electroforesis dodecyl del gel de la sulfato-poliacrilamida del sodio (SDS-PAGE) que da un alto effciency de la separación.
 La espectrometría total (ms) es el método de opción para la identificación
de las proteínas separadas, y de la espectrometría de 2-DE y total
ahora represente una tecnología por la cual vario mil proteínas se puedan separar, detectar e identificar en una manera automatizada.
La metodología de Proteomics es hecha inicialmente por la separación y la localización de la proteína por 2-DE seguido por la supresión de las proteínas del interés que entonces experimentan la digestión proteolítica para rendir una mezcla de fragmentos del péptido. Los péptidos son analizados por espectrometría total, inicialmente usando MALDI-MS para la determinación de la masa molecular y la generación de una huella digital de la masa del péptido. Si la base de datos que busca en esta etapa rinde resultados ambiguos, un análisis espectrométrico de la segunda masa, ESI-MS/MS, se utiliza para generar la información de la secuencia que se utiliza para una búsqueda más rigurosa de la base de datos.
Del espectro total obtenido en el análisis de la mezcla del resumen de la proteína, la correspondencia de la masa del péptido o la huella digital total del péptido es decir las masas moleculares de los fragmentos del péptido, puede ser comprobada. A menudo, si la secuencia de aminoácido es suffciently única y la masa
la exactitud suffciently arriba, la correspondencia total se puede utilizar para buscar bases de datos 12-15 para identificar la proteína con éxito sin la necesidad de otros análisis. Si, sin embargo, la búsqueda de la base de datos lleva a los resultados ambiguos, después análisis más futuros del ms, implicando el uso de la espectrometría total en tándem (MS/MS), se emprenden secuencialmente en cada péptido en la mezcla para generar una secuencia, o la secuencia parcial, conocida como etiqueta de la secuencia, para estos péptidos. Esto es alcanzada con frecuencia por el uso de ESI-MS/MS19 y un paso de progresión adicional de la purificación se debe realizar generalmente para separar los péptidos de las sales y de los detergentes que pueden ser presente que causan la atenuación de la señal del péptido.

Base de datos adicional que busca con ambos la masa molecular del péptido
y la información de la etiqueta de la secuencia debe llevar a la identificación inequívoca de la proteína.