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Técnicas De la Identificación De la Proteína

Las proteínas pueden ser seperated por el 2.o electrophoresis del gel e identificado con spectrometry total

El contenido proteínico de una célula se estima para consistir en millares de diversos tipos de proteínas
con un rango dinámico de la expresión. La tecnología que se está utilizando actualmente implica la extracción de los componentes de proteína, fraccionamiento de esta mezcla muy compleja,
proteolysis enzimático de cada especie separada y aislada, análisis spectrometric total extenso y finalmente corresponder con los datos estructurales generados contra una base de datos de proteínas sabidas o de productos anticipados de la expresión del genoma.
Este procedimiento implica un paso inicial usando 1 o el electrophoresis de 2 dimensiones (DE). Usando 1-DE, las proteínas se separan en base de masa molecular; la técnica es reproductiva y se puede utilizar para las proteínas en el rango total del kDa–10 300, pero ha limitado la resolución.
Para la separación de mezclas más complejas de la proteína, 2-DE es el método preferido. Esto implica el separar de las proteínas first según su carga neta por un paso de progresión el enfocarse isoeléctrico y entonces, en la segunda dimensión, según su masa molecular que emplea el electrophoresis dodecyl del gel del sulfato-sulfate-polyacrylamide del sodio (SDS-PAGE) que da una alta separación efficiency.
 El spectrometry total (MS) es el método de opción para el identification
de las proteínas separadas, y del spectrometry de 2-DE y total
ahora represente una tecnología por la cual vario mil proteínas se puedan separar, detectado e identified en una manera automatizada.
La metodología de Proteomics es hecha inicialmente por la separación y la localización de la proteína de 2-DE seguido por la supresión de las proteínas del interés que entonces experimentan la digestión proteolytic para rendir una mezcla de los fragmentos del peptide. Los peptides son analizados por el spectrometry total, usando inicialmente MALDI-MS para la determinación y la generación totales moleculares de una masa fingerprint del peptide. Si la base de datos que busca en esta etapa rinde resultados ambiguos, un análisis spectrometric de la segunda masa, ESI-MS/MS, se utiliza para generar la información de la secuencia que se utiliza para buscar más riguroso de la base de datos.
Del espectro de la masa obtenido en el análisis de la mezcla del resumen de la proteína, la correspondencia o el peptide fingerprint total de la masa del peptide es decir las masas moleculares de los fragmentos del peptide, puede ser comprobada. A menudo, si la secuencia del aminoácido es sufficiently único y la masa
la exactitud sufficiently alta, la correspondencia total se puede utilizar para buscar bases de datos 12–15 para identificar la proteína con éxito sin la necesidad de otros análisis. Si, sin embargo, el buscar de la base de datos conduce a los resultados ambiguos, después análisis más futuros del MS, implicando el uso del spectrometry total en tándem (MS/MS), se emprenden secuencialmente en cada peptide en la mezcla para generar una secuencia, o la secuencia parcial, conocida como etiqueta de la secuencia, para estos peptides. Esto es alcanzada con frecuencia por el uso de ESI-MS/MS19 y un paso de progresión adicional de purification se debe realizar generalmente para separar los peptides de las sales y de los detergentes que pueden ser presente que causan la atenuación de la señal del peptide.

Base de datos adicional que busca con ambos la masa molecular del peptide
y la información de la etiqueta de la secuencia debe conducir a la proteína inequívoca identification.