2.o Electroforesis de dos dimensiones del gel

La electroforesis de todas las proteínas celulares a través de un SDS-gel puede separar las proteínas que tienen diferencias relativamente grandes en peso molecular sin embargo, él no puede resolver fácilmente las proteínas que tienen pesos similares (e.g. una proteína 53-kDA de una proteína 52-kDA).

En el método de la electroforesis del gel 1D, las proteínas se separan en una dimensión (que sea ellas sea separado por la masa solamente).

En la 2.a electroforesis, la separación comienza con la electroforesis 1-D sin embargo allí es una segunda separación que ocurre, separando las proteínas por la carga en una dirección 90 grados del primera.

El resultado es que los analitos están separados hacia fuera a través de una superficie de dos dimensiones algo que a lo largo de una línea. Así, debido al hecho de que las proteínas sean separadas por no sólo total pero también por la carga, es inverosímil que habrá más de una proteína a la una dada el punto en el 2.o gel. Esto es porque es inverosímil que dos proteínas compartirían no sólo la misma masa exacta pero también igual carga.

Por lo tanto, en un 2.o gel, los analitos son separados más con eficacia en la 2.a electroforesis que en la electroforesis 1-D debido al segundo paso de progresión de la separación por la carga.

Para separar las proteínas de una masa similar, otra característica física de proteínas debe ser utilizada. Otra característica física importante de la proteína que se puede utilizar en la separación es la carga eléctrica, que es determinada por el número de residuos ácidos y básicos en una proteína y su carga del grupo.

Dos proteínas sin relación que tienen masas similares son poco probables tener cargas netas idénticas porque su secuencia de aminoácido sería diferente, y así la carga y el número de residuos ácidos y básicos darían una diversa carga neta. Esto permitiría que estas proteínas fueran separadas por 2.o, pero no por electroforesis del gel 1-D.

En el 2.o método de separación del gel, las proteínas son separadas realmente por la punta isoeléctrica (la punta isoeléctrica (pi) es el pH en el cual una molécula o una superficie determinada no lleva ninguna carga eléctrica neta.).

Un gradiente del pH se aplica a un gel y un potencial eléctrico es aplicado a través del gel, haciendo un extremo más positivo que el otro. En todo el aother de los pHs que su punta isoeléctrica, las proteínas serán cargadas. Si son - cargado, son tiradas hacia el extremo más negativo del gel y si están negativamente - cargado positivamente ellas serán tiradas al extremo más positivo del gel. Una vez que alcanzan la región del gel con el pH que corresponde a su punta isoeléctrica, sin embargo, neutraly se cargarán y permanecerán en ese punto.

Protocolos de la detección de la proteína para la electroforesis de dos dimensiones

Después de la separación, las proteínas se separan hacia fuera en el 2.o gel, no obstante sea invisible al ojo descubierto. Para visualizar las proteínas en el gel, los métodos muy sensibles de la coloración y de detección de las proteínas deben ser realizados.

Esto es debido a varios hechos:

1. Los carriles del gel pueden validar solamente cierto volumen de lysate de la célula o de solución de la proteína.
2. Aunque el lysate/la solución se pueda precipitar y concentrar para cargar más proteína, menos proteína se carga generalmente en el 2.o gel mientras que las cantidades excesivas de la proteína hacen difícil analizar el gel debido a las tallas de punto grandes.
3. La separación de una gran cantidad de proteína (mgs), o aún los millares de diversas proteínas a partir de un pequeño carril, en un gel relativamente grande del dimensionsional dos genera puntos de las proteínas que son abudance/concentración muy bajos (ng o los picograms!) eso es imposible o difícil de detectar por las manchas ordinarias o los métodos de detección de la proteína.
4. Una abundancia baja/bajo proteína del número de copia se puede separar, pero puede incluso no ser detectado debido al hecho de que las manchas más sensibles tienen solamente un límite de detección de alrededor de un 1/2 un nanogram. Los niveles del punto de Picogram son actualmente muy difíciles o imposibles de detectar con la coloración.

En la 2.a electroforesis, las manchas muy sensibles por lo tanto se requieren. Estas proteínas se pueden entonces detectar por una variedad de medios, pero el más común es mancha de la coloración y del coomasie de la plata.

2.os geles de coloración de plata

En la coloración de plata del 2.o gel, un coloide de plata se aplica al gel. La plata pega a los grupos de la cisteína dentro de la proteína. La plata entonces es obscurecida por la exposición a la luz UV. La oscuridad de la plata en el punto, se puede relacionar con la cantidad de plata y por lo tanto la cantidad de proteína en una localización dada en el gel. Esta medida puede dar solamente cantidades aproximadas, pero es adecuada para la mayoría de los propósitos.

Coloración de Coomasie de los 2.os geles

El tinte de Coomassie ata a las proteínas vía el physisorption a los aminoácidos tales como los aminoácidos, la arginina, y la histidina aromáticos. Coomasie también se utiliza en el método de Bradford. Se han generado las manchas no tóxicas sensibles del coomasie que permiten la visualización de los puntos que contienen menos de 1 ng de proteína.

Coloración de SYPRO de los 2.os geles

El RUBÍ de SYPRO es una 2.a mancha muy sensible del método de detección de la proteína, no prohibiendo a visualización de el cerca de 1/2 al ng de proteína en un punto dado. La desventaja es el método requiere la luz UV visualizar la mancha, así requiriendo el uso de una luz UV. Esto hace el corte de los puntos difícil y potencialmente peligroso debido a la exposición ULTRAVIOLETA posible.

Un protocolo de dos dimensiones de la electroforesis del gel para 7 cm IPG elimina la detección de Amersham GE.

2.o Preparación de la muestra del gel

• Las muestras de la proteína necesitan ser desaladas o dializaron generalmente. La diálisis se puede conducir con los bolsos grandes de la diálisis para los volúmenes grandes, o el mini resbalan-uno-lyzer (Pierce) para los pequeños volúmenes.
• La diálisis fue conducida con 1 L de 0.3mM que el bicarbonato del amonio durante 30 minutos usando resbala-uno-lyzer los kits de la diálisis (Pierce).
• Después de diálisis, las muestras fueron liofilizadas usando un liofilizador por horas de 1 ½.
• Las muestras liofilizadas entonces fueron reconstituidas con 400 l almacenador intermediario de la rehidratación.

Concentración isoeléctrica de IEF

Rehidratación del paso de progresión 1. de las tiras de IPG

• La bandeja isoelectrofocusing de la rehidratación del drystrip fue limpiada cuidadosamente con la solución de la limpieza de IPGphor (Amersham GE que detecta).
• Cerciórese de que la bandeja sea no mojada seco, pues la muestra emigrará a lo largo de los canales de agua.
• Mida con una pipeta 125 l sobre el área circular de la bandeja.
• Usando las pinzas, quite cuidadosamente las tiras de IPG de protector plástico.
• Las tiras de algún IPG tienen un coversheet plástico o eliminan la protección de la cara del gel. Quite esto usando el fórceps/las pinzas antes de usar estas tiras.
• Coloque suavemente la cara del gel de la tira abajo sobre la muestra.
• Quite cualquier burbuja.
• Coloque en el extremo del aceite mineral del carril de la bandeja y cerciórese de le empuje que traga el carril hasta que cubra totalmente la tira de IPG. Cerciórese de que caminen los recubrimientos del aceite mineral la tira del conjunto como éste previene la evaporación durante la rehidratación.