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2.o Electrophoresis De dos dimensiones Del Gel

El electrophoresis de dos dimensiones del gel (también llamado abreviado como el 2.o electrophoresis o 2-DE) es un método de electrophoresis del gel que se utilice comúnmente para separar o para analizar muy similar de tamaño, y también muchas proteínas tales como el conjunto completo de proteínas presentes en un rato dado de la célula inmediatamente, el proteome.

el 2.o electrophoresis del gel separa las proteínas en dos dimensiones, punta isoeléctrica y masa. Esto permite la separación de las proteínas que no se podrían separar o distinguir de otra manera en los geles 1-D, incluyendo las proteínas semejantemente clasificadas y muchas proteínas (tales como un proteome).

2.o Índice del gel

• 2.o Fondo Del Electrophoresis Del Gel
• 2.o Artículos Del Gel
• Separación de Isoelectric Point
• Métodos Que se manchan Del Electrophoresis De dos dimensiones Del Gel
• 2.o Protocolo Del Electrophoresis Del Gel
• Otros 2.os Protocolos Del Electrophoresis Del Gel
• 2.os Geles De Localización de averías
• 2.o ¡Foro del electrophoresis del gel (usted puede hacer cualquier pregunta acerca de 2.o aquí! También ensamble la lista que envía para recibir hasta las preguntas y las respuestas del día en los 2.os geles de otros investigadores y expertos de la ciencia!)

Fondo De dos dimensiones Del Electrophoresis Del Gel

El electrophoresis de todas las proteínas celulares a través de un SDS-gel puede separar las proteínas que tienen diferencias relativamente grandes en peso molecular sin embargo, él no puede resolver fácilmente las proteínas que tienen pesos similares (e.g. una proteína 53-kDA de una proteína 52-kDA).

En el método del electrophoresis del gel del 1D, las proteínas se separan en una dimensión (que sea ellas sea separado por la masa solamente).

En el 2.o electrophoresis, la separación comienza con el electrophoresis 1-D sin embargo allí es una segunda separación que ocurre, separando las proteínas por la carga en una dirección 90 grados del primera.

El resultado es que los analytes están separados hacia fuera a través de una superficie de dos dimensiones más bien que a lo largo de una línea. Así, debido al hecho de que las proteínas son separadas por no solamente total pero también por la carga, es inverosímil que habrá más de una proteína a la una dada el punto en el 2.o gel. Esto es porque es inverosímil que dos proteínas compartirían no solamente la misma masa exacta pero también igual carga.

Por lo tanto, en un 2.o gel, los analytes son separados más con eficacia en el 2.o electrophoresis que en el electrophoresis 1-D debido al segundo paso de progresión de la separación por la carga.

El 2.o método de la separación del gel de Isoelectric Point

Para separar las proteínas de una masa similar, otra característica física de proteínas debe ser utilizada. Otra característica física importante de la proteína que se puede utilizar en la separación es la carga eléctrica, que es determinada por el número de residuos ácidos y básicos en una proteína y su carga del grupo.

Dos proteínas sin relación que tienen masas similares son poco probables tener cargas netas idénticas porque su secuencia del aminoácido sería diferente, y así la carga y el número de residuos ácidos y básicos darían una diversa carga neta. Esto permitiría que estas proteínas fueran separadas por 2.o, pero no por electrophoresis del gel 1-D.

En el 2.o método de la separación del gel, las proteínas son separadas realmente por la punta isoeléctrica (la punta isoeléctrica (pi) es el pH en el cual una molécula o una superficie determinada no lleva ninguna carga eléctrica neta).

Un gradiente del pH se aplica a un gel y un potencial eléctrico se aplica a través del gel, haciendo un extremo más positivo que el otro. En todo el aother de los pHs que su punta isoeléctrica, las proteínas serán cargadas. Si se cargan positivamente, serán tiradas hacia el extremo más negativo del gel y si se cargan negativamente serán tirados al extremo más positivo del gel. Una vez que alcancen la región del gel con el pH que corresponde a su punta isoeléctrica, sin embargo, neutraly se cargarán y permanecerán en ese punto.

2.o Métodos Que se manchan Del Electrophoresis Del Gel

Protocolos de la detección de la proteína para el electrophoresis de dos dimensiones

Después de la separación, las proteínas se separan hacia fuera en el 2.o gel, no obstante sea invisible al ojo descubierto. Para visualizar las proteínas en el gel, los métodos muy sensibles el mancharse y de detección de las proteínas deben ser realizados.

Esto es debido a varios hechos:

1. Los carriles del gel pueden validar solamente cierto volumen del lysate de la célula o de la solución de la proteína.
2. Aunque el lysate/solution se puede precipitar y concentrar para cargar más proteína, menos proteína se carga generalmente en el 2.o gel mientras que las cantidades excesivas de la proteína hacen difícil de analizar el gel debido a las tallas grandes del punto.
3. La separación de una cantidad grande de proteína (mgs), o aún los millares de diversas proteínas a partir de un carril pequeño, en un gel relativamente grande del dimensionsional dos genera puntos de las proteínas que son abudance/concentración muy bajos (ng o los picograms!) eso es imposible o difícil de detectar por las manchas ordinarias o los métodos de detección de la proteína.
4. Una abundancia baja/bajo copia la proteína del número se puede separar, pero puede incluso no ser detectado debido al hecho de que las manchas más sensibles tienen solamente un límite de detección de alrededor de un 1/2 un nanogram. Los niveles del punto de Picogram son actualmente muy difíciles o imposibles detectar con mancharse.

En el 2.o electrophoresis, las manchas muy sensibles por lo tanto se requieren. Estas proteínas se pueden entonces detectar por una variedad de medios, pero el más común es mancha el mancharse y del coomasie de la plata.

2.os Geles Que se manchan De plata

En mancharse de plata del 2.o gel, un coloide de plata se aplica al gel. La plata pega a los grupos del cysteine dentro de la proteína. La plata entonces es obscurecida por la exposición a la luz UV. La oscuridad de la plata en el punto, se puede relacionar con la cantidad de plata y por lo tanto la cantidad de proteína en una localización dada en el gel. Esta lata de la medida da solamente cantidades aproximadas, pero es adecuada para la mayoría de los propósitos.

El mancharse de Coomasie de los 2.os geles

El tinte de Coomassie ata a las proteínas vía el physisorption a los aminoácidos tales como los aminoácidos, el arginine, y el histidine aromáticos. Coomasie también se utiliza en el método de Bradford. Se han generado las manchas no tóxicas sensibles del coomasie que permiten la visualización de los puntos que contienen menos de 1 ng de proteína.

El mancharse de SYPRO de los 2.os geles

El RUBÍ de SYPRO es una 2.a mancha muy sensible del método de detección de la proteína, no prohibiendo a visualización de el cerca de 1/2 al ng de proteína en un punto dado. La desventaja es el método requiere la luz UV visualizar la mancha, así requiriendo el uso de una luz UV. Esto hace el corte de los puntos difícil y potencialmente peligroso debido a la exposición UV posible.

 

2.o Protocolo Del Electrophoresis Del Gel

Un protocolo de dos dimensiones del electrophoresis del gel para 7 centímetros IPG elimina la detección de la GE de Amersham.

2.o Preparación De la Muestra Del Gel

• Las muestras de la proteína necesitan ser desaladas o dializaron generalmente. La diálisis se puede conducir con los bolsos grandes de la diálisis para los volúmenes grandes, o el mini resbalan -uno-lyzer (perfore) para los volúmenes pequeños.
• La diálisis fue conducida con 1 L del bicarbonato del amonio de los 0.3mM sobre 30 minutos que el usar resbala -uno-lyzer kits de la diálisis (perfore).
• Después de diálisis, las muestras fueron liofilizadas usando un lyophilizer para 1 ½ horas.
• Las muestras liofilizadas entonces fueron reconstituidas con 400 l almacenador intermediario de la rehidratación.

 

El Enfocarse Isoeléctrico de IEF

Paso de progresión 1. Rehidratación de las tiras de IPG

• La bandeja isoelectrofocusing de la rehidratación del drystrip fue limpiada cuidadosamente con la solución de la limpieza de IPGphor (GE de Amersham que detecta).
• Cerciórese de que la bandeja sea no mojada seco, pues la muestra emigrará a lo largo de los canales del agua.
• Mida con una pipeta 125 l sobre el área circular de la bandeja.
• Con las pinzas, quite cuidadosamente las tiras de IPG de protector plástico.
• Las tiras de algún IPG tienen un coversheet plástico o eliminan la protección de la cara del gel. Quite este fórceps/pinzas que usan antes de usar estas tiras.
• Coloque suavemente la cara del gel de la tira abajo sobre la muestra.
• Quite cualquier burbuja.
• Coloque en el extremo del aceite mineral del carril de la bandeja y cerciórese de usted empuje que traga el carril hasta que cubre totalmente la tira de IPG. Cerciórese de que caminen los recubrimientos del aceite mineral la tira del conjunto como éste previene la evaporación durante la rehidratación.

 

 

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