Mancha blanca /negra occidental

¡Ahora aprenda que todo allí está sobre manchas blancas /negras occidentales!

- Muestra Prepartation

- Lysing el almacenador intermediario

- Anticuerpo

- Lysing las células

- Preparación del gel

- Gel que se ejecuta

- Transferencia del gel

- Controles

- Mancha blanca /negra occidental

- Lectura

- Análisis e interpretación

Si usted tiene células No-adherentes (tales como líneas del T-cell o glóbulos periféricos) o células adherentes (tales como células del fibroblasto o células de LECHUGA ROMANA), usted necesita quitar las proteínas extrañas de los media. Para las células no-adherentes usted puede granularlas suavemente con la centrifugación y después lavar la pelotilla con PBS. Para las células adherentes, la colada simple el frasco o el plato con PBS antes de la mancha blanca /negra occidental.

El análisis occidental de la mancha blanca /negra examina las proteínas, y así que quisiéramos las proteínas sean desbloquear de las células y también evitaran que las proteínas sean cortadas por las proteasas. Necesitamos éstos a la mancha blanca /negra occidental:

¡- para mantener cosas frías! 4C en el hielo durante la lisis de la célula para borrar occidental

- utilice el detergente para romper para arriba las membranas de células para release/versión las proteínas

- Almacenador intermediario

- Inhibidores (inhibidores de proteasa e inhibidores de la fosfatasa si hacemos la mancha blanca /negra occidental para las fosfoproteínas)

Detergente - Lysing las células para la mancha blanca /negra occidental

El SDS y RIPA son los detergentes que se utilizan para solubilizar las proteínas para el análisis posterior usando borrar occidental. Esto se requiere tantas proteínas está dentro de la célula o de las membranas celulares interiores localizadas, así que necesitamos release/versión estas proteínas para poder al immunoblot para ellas.

Usted debe seleccionar un anticuerpo para utilizar para la mancha blanca /negra occidental. Generalmente se utilizan los anticuerpos monoclonales del ratón o los anticuerpos policlonales del conejo.

Usted puede utilizar o un anticuerpo sin ningunos grupos agregados, o utilice un anticuerpo que se conjugue a la biotina. Estos anticuerpos no requieren

Policlonal contra los anticuerpos monoclonales para la mancha blanca /negra occidental

Los anticuerpos monoclonales son generalmente mejores para borrar occidental debido a:

- una mejor relación de transformación de señal/interferencia (un fondo más bajo en mancha blanca /negra occidental)

- su especificidad más alta (usted consigue menos proteínas o Ig contaminantes)

- resultados totales del producto de limpieza de discos en la película que borra occidental (vendas menos no específicas detectadas)

Los anticuerpos policlonales se adaptan mejor para la inmunoprecipitación:

- reconocen más epitopos

- tenga avidez más alta

Las EXTREMIDADES antes de usted lyse para borrar occidental:

Si usted va a la mancha blanca /negra occidental para la masa de la proteína (IE una proteína que no es phosphorylated):

- usted puede lyse en volúmenes más grandes (que guardan el resto para borrar para otras proteínas)

Si usted va a la mancha blanca /negra occidental una fosfoproteína (o proteína phosphorylated) es importante hacer el siguiente:

¡- cerciórese de le los inhibidores de la fosfatasa del uso (tales como vanadate porque las fosfatasas quitarán los fosfatos de sus proteínas! )

- también lyse las células en el volumen más pequeño posible (se hace el IE lyse en el almacenador intermediario del cargamento de la UL 100, éste porque usted puede cargar la mayor parte de las células que usted lysed. Esto es tan importante que la señal es absolutamente débil cuando el borrar occidental para las fosfoproteínas.)

Si usted está mirando interacciones de la proteína-proteína:

- no utilice el SDS como disocia interacciones de la proteína-proteína y las proteínas se desnaturalizan así (especialmente después de hervir)

- para las interacciones occidentales de la proteína-proteína que borran, interacciones nativas del IE usted debe utilizar un detergente menos-riguroso tal RIPA.

El Lysing:

- puede ser hecho directamente en la placa o el plato

- granule las células

- Guarde en el hielo y el frío - utilice un cubo de hielo

- Regla empírica para que cuánto almacenador intermediario de la lisis es utilice: 10^5 células/UL del almacenador intermediario de la lisis

- recoja en tubos del eppendorf y etiquete (guarde éstos en el hielo)

Mida la proteína total antes de análisis occidental de la mancha blanca /negra:

- esto permite un análisis más cuantitativo si usted quiere comparar condiciones del tratamiento en análisis occidental de la mancha blanca /negra

- los kits comerciales están disponibles por ejemplo un análisis de Bradford para medir la proteína total (del Bio-Rad)

- 0.1% de SDS o mayor pueden interferir con la medida de la proteína

Desnaturalice las muestras de la proteína:

- agregue el almacenador intermediario de la muestra del cargamento de la proteína a una parte alícuota de lysate de la célula - contiene el tinte (vea también la migración en un gel, el 2% SDS)

- agregue el reductor del disulfuro tal como beta - mercaptoetanol

- Ebullición en el bloque del baño de agua o de la calefacción (temperaturas más bajas tales como mediados de - 90 grados disminuyen la agregación de la proteína).

- Empuje un agujero en casquillo de cada tubo para evitar el hacer estallar

Los geles de SDS-PAGE son las matrices del gel que son utilizadas para separar las proteínas por talla en presencia de corriente eléctrica. Los geles bajos del porcentaje separan proteínas más grandes mientras que geles más altos del porcentaje separan proteínas más pequeñas mejor. El problema es que todas las proteínas tienen encargado asociado de ellos, y en una corriente eléctrica ésta podría causar problemas. Esto es solucionada por la adición de SDS a las muestras de la proteína. El SDS ata a las proteínas cada pocos aminoácidos y neutraliza las diferencias de la carga que las proteínas tienen. Esto permite que las proteínas sean separadas por talla y no por la carga.

- dependiendo de cuánto proteína usted querrá cargar para borrar occidental, usted debe utilizar los pequeños peines o peines más grandes.

- el porcentaje de la acrilamida es importante. Se utiliza la acrilamida del generalmente 10%.

- Un gel de resolución se utiliza en la parte inferior con un pH de 8.8

- Un gel que empila (4-5%) pH 6.8 se utiliza para pila de discos las proteínas adentro junto después de cargar

- La polimerización de geles es aumentada en los catalizadores los APS y TEMED que aceleran la reacción de la polimerización (formación y solidificación) del gel de poliacrilamida.

- Cargue cada muestra cuidadosamente y prevenir lentamente la muestra que se escapa fuera del carril.

- Cargue cada carril y utilice el almacenador intermediario de la muestra en cada uno (prevenir diferencias adentro).

1. Centrifugue las muestras para el sec 10 después de hervir.
2. Cargue la muestra en cada carril
3. Cargue la referencia del MW
4. Funcione con el gel en 100V (voltaje constante) o aún mejórelo en 40 mA (corriente constante). Mire la etiqueta de plástico/la escala de la proteína o teña el frente para que cuándo pare el gel. La corriente constante da resultados mejores y más sostenidos si usted tiene el tiempo.

- reloj para las burbujas entre el vidrio y bajo el gel - esto significa que está trabajando

¡- reloj para la migración de la proteína (debe ir abajo) - si no usted ha cambiado los terminales de componente y puede perder todas sus muestras!

- Ejecútese inicialmente lentamente a través del gel que empila (~ 50 voltios), éste da vendas más sostenidas.

- No se ejecute durante la noche

- No sobrecaliente el gel (esto hace el gel perder rigidez, llevando a los pobres resoloving y a las vendas gravemente formadas borrosas)

Seleccione el tipo de la membrana:

Puede utilizar cualquiera:

- Membrana de PVDF para las manchas blancas /negras occidentales

- Membrana de la nitrocelulosa para las manchas blancas /negras occidentales

- Membrana de nylon (ahora usada raramente - puede rasgar)

Extremidades para transferir a la membrana occidental:

¡- Guantes del desgaste siempre! Utilice el fórceps

- Reduzca al mínimo el tacto/el fórceps a la membrana

Orden de transferencia Bio-RAD:

(-)
esponja en negro
papel de filtro
nitrocelulosa del gel
papel de filtro
esponja
(+)

Transferencia:

- Mantenga fresco 4C

- Transferencia durante la noche en 35 V

- Puede transferir rápidamente sobre 1 hora en un V más alto

El bloqueo de membranas permite que usted maximice la señal: relación de transformación del ruido

- guantes del desgaste

- Bloque con el 5% mamado (leche seca sin materias grasas - polvo) o 1 - el 5% BSA (albúmina del suero vacuno) para las proteínas phosphorylated.

- El almacenador intermediario es TBST

El lavarse después de bloquear

- el lavarse después de bloquear pasos de progresión no es crítico, pues bloque de la gente a menudo durante incubaciones primarias del anticuerpo.

- el lavado se hace generalmente con el almacenador intermediario de TBST. Puede ser hecho rápidamente con un de gran capacidad de TBST.

Incubación con el anticuerpo primario

- el ratón, el conejo o la otra especie

- generalmente 1: dilusión 1000 con TBST

- si el alto fondo/muchas vendas no específicas es un problema, las incubaciones se pueden hacer con el 5% BSA o leche.

El lavarse después de anticuerpo primario

- no tan crítico

- puede lavarse rápidamente con los volúmenes grandes de TBST

Incubación del anticuerpo secundario

- 1 generalmente diluido: 10, 000 con TBST

- el anti-ratón, el anti-conejo, o el otro anticuerpo conjugado con la enzima de HRP para la detección

El lavarse después de anticuerpo secundario

- CRÍTICO

- Colada 5 X por 5 minutos con TBST.

- Si usted debe acometer realmente, lavar por lo menos 3 veces con volúmenes más grandes de TBST.

Prueba para los resultados

- el ECL (quimioluminescencia realzada) se utiliza generalmente

- se expone y se desarrolla la película. La exposición por 10 segundos está generalmente bastante para la proteína total. Las fosfoproteínas pueden requerir 2 - 20 exposiciones minuciosas.

- la película es generalmente XOMAT o película “rápida” similar

WB - mancha blanca /negra occidental

IB - immunoblot (otro término para borrar occidental)

SDS - Sulfato Dodecyl de sodio (un detergente usado en muchas soluciones que borran occidentales)

PAGINACIÓN - electroforesis del gel de Polyacrilamide

Ab - Anticuerpo (los anticuerpos se utilizan para detectar su proteína del interés)

HRP - Peroxidasa del rábano picante

Luminol - substrato que HRP hiende para causar a formación ligera

ECL - Quimioluminescencia realzada (solución occidental de la mancha blanca /negra de la cual realza la formación ligera HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (la mayoría del promedio de las proteínas entre el kDa 30 - 80)

RAM - anti-ratón Ig del conejo

Ig - inmunoglobulina (un isotipo del anticuerpo)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoruro del phenylmethylsulfonyl

BSA - Albúmina del suero vacuno

NFDM - Leche seca sin materias grasas