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Mancha blanca /negra Occidental

AUDIO: ¡Escuche una explicación occidental detallada de la mancha blanca /negra! Cortesía: Instituto De Investigación Humano Nacional Del Genoma.

Definición Occidental De la Mancha blanca /negra: El borrar occidental es una técnica usada para identificar y para localizar las proteínas basadas en su capacidad de atar a los anticuerpos específicos.

   El análisis occidental de la mancha blanca /negra puede detectar su proteína del interés de una mezcla de una gran cantidad de proteínas.  El borrar occidental puede darle la información sobre la talla de su proteína (con la comparación a una etiqueta de plástico o una escala de la talla en kDa), y también le da la información sobre la expresión de la proteína (con la comparación a un control tal como muestra untreated u otro tipo o tejido fino de la célula). 

Resumen: La mancha blanca /negra occidental le da la información sobre:

Talla de su proteína

Cantidad de la expresión de su proteína

El análisis occidental de la mancha blanca /negra puede analizar cualquier muestra de la proteína si de las células o de los tejidos finos, pero también puede analizar las proteínas recombinant sintetizadas in vitro. La mancha blanca /negra occidental es dependiente en la calidad del anticuerpo que usted utiliza sondar para su proteína del interés, y cómo el específico él está para esta proteína. Los anticuerpos son fácilmente obtenibles ahora de fuentes comerciales, y usted puede comprar uno para su proteína del interés. Si su proteína es una proteína de la novela, usted debe producir un anticuerpo usted mismo o conseguir a una compañía hacerla para usted. En este caso usted necesitará por lo menos una cantidad pequeña de su proteína purificada de los extractos de la célula o hecha como recombinant (IE in vitro o en un sistema recombinant de la expresión de la proteína).   ¡Los anticuerpos específicos a su proteína son vitales a borrar occidental pues pueden atar específicamente a su proteína del interés en vez de los millares de proteínas en su mancha blanca /negra occidental!

Cuadro 1. Detalles de los pasos de progresión implicados en la obtención de la proteína para la mancha blanca /negra occidental.

  Cuadro 2. Calcule detallar los pasos de progresión en conducir una mancha blanca /negra occidental.

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¿Cómo El Borrar Occidental Trabaja?

Vea el diagrama 1 abajo. Primeras cosas primeras. Obtenga una muestra de la proteína que usted desea analizar, por ejemplo muestras de la célula. Lyse las células para release/versión contenidos proteínicos. Ejecute éstos en un gel que separe las proteínas en base de talla. Entonces transfiera estas proteínas del gel sobre una membrana usando electricidad. Esta membrana se puede entonces utilizar para sondar para las proteínas del interés usando un anticuerpo primario.

Qué usted necesita la mancha blanca /negra occidental:

Una Muestra De la Proteína

Un buen anticuerpo para detectar su proteína del interés

¡La mancha blanca /negra occidental confía en el anticuerpo primario para detectar esta proteína de los millares de proteínas en su membrana y previamente en su gel! (una célula puede contener 30.000 diversas proteínas - y estas mismas proteínas se pueden incluso alterar dándole sobre 300.000 diversas proteínas!). ¡Usar un anticuerpo reconoce su anticuerpo primario (un anticuerpo secundario) que usted acumula un emparedado del protei'na-anticuerpo-anticuerpo!  ¡El anticuerpo secundario tiene una enzima del peroxidase del rábano picante que convierta un substrato del luminol a una sustancia de release/versión ligera! Esta luz se detecta como punto en la película. De este punto usted puede determinarse cuánto proteína está allí concerniente a otros puntos, o la talla de la proteína concerniente a una etiqueta de plástico de la talla que se ejecuta también en el gel.

El diagrama 2 muestra un gel occidental del ejemplo de la mancha blanca /negra. El carril 1 es una escala de la etiqueta de plástico de la talla de la proteína que muestra diversas tallas sabidas de proteínas, esto puede ser comprado comercialmente y las tallas de todos los puntos se dan en un folleto. El carril 3 es una muestra del cáncer y el carril 5 es una muestra normal. Como usted puede ver la proteína en el carril 3 tiene una expresión más alta que la muestra del cáncer en el carril 5, que es interesante. También, los puntos de la proteína en los carriles 3 y 5 son del mismo taman-o que el 2do punto en la escala de la talla del carril 1. Podemos entonces mirar la talla sabida de la proteína de nuestro folleto que recibimos con la escala. Entonces nos determinamos que la talla de la proteína es el kDa 80. Nuestra proteína del interés es también el kDa 80. ¡Sabemos tan que la mancha blanca /negra occidental trabajó y que la proteína está expresada altamente en una muestra del cáncer!

Para detectar su proteína:

Compre un anticuerpo contra su fuente primaria del anticuerpo

Utilice un ECL - kit y película de la quimioluminescencia para conseguir los resultados

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Diagrama 1.                                                                                                                                      Diagrama 2.

¡Ahora aprenda que todo allí está sobre manchas blancas /negras occidentales!

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Índice, en la orden hecha para la mancha blanca /negra occidental:

Pasos de progresión en borrar occidental:

- preparándose para la mancha blanca /negra occidental

- que anticuerpo a utilizar para las manchas blancas /negras occidentales

- lysing las células para la mancha blanca /negra occidental

- Información Del Gel de SDS-PAGE

- preparación del gel de SDS-PAGE para las manchas blancas /negras occidentales

- electrophoresis del gel - ejecutar el gel

- Tranfer de proteínas a la membrana para borrar occidental

- Mancha blanca /negra Occidental

Términos y definiciones usados en análisis occidental de la mancha blanca /negra

¡Los Asuntos Occidentales Más últimos De la Mancha blanca /negra!

 

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Pasos de progresión en análisis occidental de la mancha blanca /negra:

- Muestra Prepartation

- Lysing El Almacenador intermediario

- anticuerpo

- Lysing Las Células

- Preparación Del Gel

- Gel Que se ejecuta

- transferencia del gel

- controles

- Mancha blanca /negra Occidental

- lectura

- análisis e interpretación

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Para preparar las muestras para la mancha blanca /negra occidental:

Si usted tiene células No-adherentes (tales como líneas de la T-ce'lula o células de sangre periféricas) o células adherentes (tales como células del fibroblast o células de LECHUGA ROMANA), usted necesita quitar las proteínas extrañas de los media. Para las células no-adherentes usted puede granularlas suavemente con la centrifugación y después lavar la pelotilla con PBS. Para las células adherentes, la colada simple el frasco o el plato con PBS antes de la mancha blanca /negra occidental.

 

El análisis occidental de la mancha blanca /negra examina las proteínas, y así que quisiéramos las proteínas sean desbloquear de las células y también evitaran que las proteínas sean cortadas para arriba por los proteases. Necesitamos éstos a la mancha blanca /negra occidental:

¡- para mantener cosas frías! 4C en el hielo durante el lysis de la célula para borrar occidental

- utilice el detergente para romper para arriba las membranas de células para release/versión las proteínas

- almacenador intermediario

- inhibidores (inhibidores del protease e inhibidores del phosphatase si hacemos la mancha blanca /negra occidental para los phospho-proteins)

 

Detergente - Lysing Las Células Para La Mancha blanca /negra Occidental

El SDS y RIPA son los detergentes que se utilizan para solubilizar las proteínas para un análisis más último usando borrar occidental. Esto se requiere tantas proteínas está dentro de la célula o de las membranas interiores localizadas de la célula, así que necesitamos release/versión estas proteínas para poder al immunoblot para ellas.

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¿Qué anticuerpo debo utilizar para borrar occidental?

Usted debe seleccionar un anticuerpo para utilizar para la mancha blanca /negra occidental. Generalmente se utilizan los anticuerpos monoclonal del ratón o los anticuerpos del polyclonal del conejo.

Usted puede utilizar o un anticuerpo sin ningunos grupos agregados, o utilice un anticuerpo que se conjugue al biotin. Estos anticuerpos no requieren

 

Polyclonal contra los anticuerpos monoclonal para la mancha blanca /negra occidental

Los anticuerpos monoclonal son generalmente mejores para borrar occidental debido a:

- una relación de transformación mejor de la señal/interferencia (un fondo más bajo en mancha blanca /negra occidental)

- su especificidad más alta (usted consigue menos proteínas o Ig de contaminación)

- resultados totales del producto de limpieza de discos en la película que borra occidental (vendas menos no específicas detectadas)

 

Los anticuerpos de Polyclonal se satisfacen mejor para la inmunoprecipitación:

- reconocen más epitopes

- tenga avidity más alto

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Lysing las células para la mancha blanca /negra occidental:

Las EXTREMIDADES antes de usted lyse para borrar occidental:

Si usted va a la mancha blanca /negra occidental para la masa de la proteína (IE una proteína que no es phosphorylated):

- usted puede lyse en volúmenes más grandes (que guardan el resto para borrar para otras proteínas)

 

Si usted va a la mancha blanca /negra occidental un phospho-protein (o proteína phosphorylated) es importante hacer el siguiente:

¡- se cerciora de usted los inhibidores del phosphatase del uso (tales como vanadate porque los phosphatases quitarán los fosfatos de sus proteínas! )

- también lyse las células en el volumen más pequeño posible (se hace el IE lyse en el almacenador intermediario del cargamento de la UL 100, éste porque usted puede cargar la mayoría de las células que usted lysed. Esto es tan importante que la señal es absolutamente débil cuando el borrar occidental para los phospho-proteins.)

 

Si usted está mirando interacciones de la protei'na-protei'na:

- no utilice el SDS como disocia interacciones de la protei'na-protei'na y las proteínas se desnaturalizan así (especialmente después de hervir)

- para las interacciones occidentales de la protei'na-protei'na que borran, interacciones nativas del IE usted debe utilizar un detergente menos-riguroso tal RIPA.

 

El lysing:

- puede ser hecho directamente en la placa o el plato

- granule las células

- guarde en el hielo y el frío - utilice un cubo de hielo

- regla del pulgar para que cuánto almacenador intermediario del lysis es utilice: células 10^5/uL del almacenador intermediario del lysis

- recoja en tubos y escritura de la etiqueta del eppendorf (guarde éstos en el hielo)

 

Mida la proteína total antes de análisis occidental de la mancha blanca /negra:

- esto permite un análisis más cuantitativo si usted desea comparar condiciones del tratamiento en análisis occidental de la mancha blanca /negra

- los kits comerciales están disponibles por ejemplo un análisis de Bradford para medir la proteína total (del Bio-Bio-Rad)

- 0.1% del SDS o de la mayor lata interfieren con la medida de la proteína

 

Desnaturalice Las Muestras De la Proteína:

- agregue el almacenador intermediario de la muestra del cargamento de la proteína a una parte alícuota de lysate de la célula - contiene el tinte (vea también la migración en un gel, el 2% SDS)

- agregue el agente de reducción del disulfuro tal como beta - mercaptoethanol

- ebullición en el bloque del baño de agua o de la calefacción (temperaturas más bajas tales como mediados de - 90 grados disminuyen la agregación de la proteína).

- empuje un agujero en casquillo de cada tubo para evitar el hacer estallar

 

Información del gel de SDS-PAGE para borrar occidental

Los geles de SDS-PAGE son las matrices del gel que son utilizadas para separar las proteínas por talla en la presencia de la corriente eléctrica. Los geles bajos del porcentaje separan proteínas más grandes mientras que geles más altos del porcentaje separan proteínas más pequeñas mejor. El problema es que todas las proteínas tienen cargado asociado con ellos, y en una corriente eléctrica ésta podría causar problemas. Esto es solucionada por la adición del SDS a las muestras de la proteína. El SDS ata a las proteínas cada pocos aminoácidos y neutraliza las diferencias de la carga que las proteínas tienen. Esto permite que las proteínas sean separadas por talla y no por la carga.

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Preparación del gel de SDS-PAGE para la mancha blanca /negra occidental

- dependiendo de cuánto proteína usted deseará cargar para borrar occidental, usted debe utilizar los peines pequeños o peines más grandes.

- el porcentaje de la acrilamida es importante. Se utiliza la acrilamida del generalmente 10%.

- un gel de resolución se utiliza en el fondo con un pH de 8.8

- un gel que empila (4-5%) pH 6.8 se utiliza para pila de discos las proteínas adentro junto después de cargar

- la polimerización de geles es aumentada en los catalizadores APS y TEMED que aceleran la reacción de la polimerización (formación y solidificación) del gel de poly-acrylamide.

- cargue cada muestra cuidadosamente y prevenir lentamente la muestra que se escapa fuera del carril.

- cargue cada carril y utilice el almacenador intermediario de la muestra en cada uno (prevenir diferencias adentro).

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Gelifiqúese El Electrophoresis

1. Centrifugue las muestras para 10 sec después de hervir.
2. Cargue la muestra en cada carril
3. Cargue la referencia del MW
4. Ejecute el gel en 100V (voltaje constante) o aún mejórelo en 40 mA (corriente constante). Mire la proteína marker/ladder o tiña el frente para que cuándo pare el gel. La corriente constante da resultados mejores y más sostenidos si usted tiene el tiempo.

- reloj para las burbujas entre el cristal y bajo el gel - esto significa que está trabajando

¡- reloj para la migración de la proteína (debe ir abajo) - si no usted ha cambiado los terminales de componente y puede perder todas sus muestras!

- ejecútese inicialmente lentamente a través del gel que empila (~ 50 voltios), éste da vendas más sostenidas.

- no se ejecute durante la noche

- no sobrecaliente el gel (esto hace el gel perder rigidez, conduciendo a los pobres resoloving y a las vendas gravemente formadas blurry)

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Tranfer de proteínas a la membrana para borrar occidental

Seleccione El Tipo De la Membrana:

Puede utilizar cualquiera:

- membrana de PVDF para las manchas blancas /negras occidentales

- membrana de la nitrocelulosa para las manchas blancas /negras occidentales

- membrana de nylon (ahora usada raramente - puede rasgarse)

 

Extremidades para Transfering a la membrana occidental:

¡- guantes del desgaste siempre! Utilice el fórceps

- reduzca al mínimo touching/forceps a la membrana

 

Orden de la transferencia Bio-Bio-RAD:

(-)
esponja en negro
papel de filtro
nitrocelulosa del gel
papel de filtro
esponja
(+)

Transferencia :

- mantenga fresco 4C

- transferencia durante la noche en 35 V

- puede transferir rápidamente sobre 1 hora en un V más alto

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Mancha blanca /negra Occidental

El bloqueo de membranas permite que usted maximice la relación de transformación de signal:noise

- guantes del desgaste

- bloque con el 5% Blotto (leche seca sin materias grasas - polvo) o 1 - el 5% BSA (albúmina del suero vacuno) para las proteínas phosphorylated.

- el almacenador intermediario es TBST

El Lavarse Después De Bloquear

- el lavarse después de bloquear pasos de progresión no es crítico, pues bloque de la gente a menudo durante incubaciones primarias del anticuerpo.

- el lavado se hace generalmente con el almacenador intermediario de TBST. Puede ser hecho rápidamente con un volumen grande de TBST.

Incubación con el anticuerpo primario

- el ratón, el conejo o la otra especie

- generalmente 1: dilusión 1000 con TBST

- si las vendas no específicas altas de background/many son un problema, las incubaciones se pueden hacer con el 5% BSA o leche.

El lavarse después de anticuerpo primario

- no tan crítico

- puede lavarse rápidamente con los volúmenes grandes de TBST

Incubación del anticuerpo secundario

- 1 generalmente diluido: 10. 000 con TBST

- el contra-rato'n, el contra-conejo, o el otro anticuerpo conjugado con la enzima de HRP para la detección

El Lavarse Después De Anticuerpo Secundario

- CRÍTICO

- colada 5 X por 5 minutos con TBST.

- si usted realmente debe acometer, lavar por lo menos 3 veces con volúmenes más grandes de TBST.

Prueba para los resultados

- el ECL (quimioluminescencia realzada) se utiliza generalmente

- se expone y se desarrolla la película. La exposición por 10 segundos está generalmente bastante para la proteína total. Los phospho-proteins pueden requerir 2 - 20 exposiciones minuciosas.

- la película es generalmente XOMAT o película ' rápida ' similar

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Vea La Mancha blanca /negra Occidental De Localización de averías

Términos usados en borrar occidental:

WB - mancha blanca /negra occidental

IB - immunoblot (otro término para borrar occidental)

Sds - sulfato dodecyl de sodio (un detergente usado en muchas soluciones que borran occidentales)

PAGINACIÓN - Electrophoresis Del Gel De Polyacrilamide

Ab - anticuerpo (los anticuerpos se utilizan para detectar su proteína del interés)

HRP - Peroxidase Del Rábano picante

Luminol - substrato que HRP hiende para causar a formación ligera

Ecl - quimioluminescencia realzada (solución occidental de la mancha blanca /negra de la cual realza la formación ligera HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (la mayoría del promedio de las proteínas entre el kDa 30 - 80)

RAM - contra-rato'n Ig del conejo

Isotype del anticuerpo de Ig - de Immunoglobulin(an)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluoruro del phenylmethylsulfonyl

BSA - Albúmina Del Suero Vacuno

NFDM - leche seca sin materias grasas

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