Manchas blancas /negras occidentales de localización de averías

- Transferencia de los pobres debido a las burbujas de aire durante transferencia a la membrana

- película sucia al agregar al revelador

- los rodillos de revelador son sucios

Solución a los puntos en la película:

- utilice una pipeta del pasteur como rodillo. ruede la membrana y el gel antes de transferencia para quitar burbujas. mantenga la membrana y los materiales mojados.

- mantenga la película limpia antes de agregar al revelador

Problema occidental de localización de averías de las manchas blancas /negras:

- generalmente debido a muchas vendas no específicas

- calidad primaria pobre del anticuerpo o anticuerpo viejo

- no bastante bloqueando

- hendidura proteolítica del antígeno - todas las vendas adicionales son un MW más bajo que su proteína, (se está detectando pero fue degradado el IE su proteína)

Soluciones a demasiadas vendas en mancha blanca /negra occidental:

- compre otro anticuerpo o substitúyalo por una acción fresca del anticuerpo

- bloque con leche sin materias grasas seca del 5% o BSA antes del adición primario. Si usted está bloqueando ya, considere bloquear durante incubaciones primarias y secundarias del anticuerpo y también aumentar bloqueando la leche o la concentración de BSA.

- guarde todo en el hielo, utilice las muestras frescas, salve adentro - 80C, y utilice los inhibidores de proteasa tales como PMSF

Problema occidental de localización de averías de las manchas blancas /negras:

- negro o cada película oscura; la película fue expuesta demasiado de largo

- el bloqueo era escaso; el atascamiento no específico del anticuerpo primario y los anticuerpos secundarios no fueron lavados totalmente

- el lavado era escaso

¡- la película brilla intensamente en obscuridad! - dilusiones secundarias o primarias demasiado altas

Soluciones a la película oscura:

- exposición por menos tiempo, tiempo de exposición de la disminución

- aumente el bloqueo de la duración de la incubación sin materias grasas de la leche seca el 5% o aumente la concentración.

- también usted puede intentar bloquear con el suero entero del animal del ordenador principal con (o antes) el anticuerpo secundario

- aumente las épocas y los volúmenes que se lavan de ayudar a quitar cualquier señal no específica debido al atascamiento débil del anticuerpo.

¡- usando un detergente más fuerte lavarse - en vez de TBST (Tween-20), utilizar detergentes más fuertes tales como NP-40 o SDS que puedan proporcionar a una colada más rigurosa y reducir el fondo (hacen esto solamente si usted congriega es fuertes! - el lavarse también quita alguna su venda del interés!)

- concentración secundaria muy alta del anticuerpo (o aún primario) - realice los experimentos de la optimización para determinar dilusiones apropiadas del anticuerpo. diluya los anticuerpos más futuros.

Problema occidental de localización de averías de las manchas blancas /negras:

- debido a no bastante proteína cargó en el gel

- el anticuerpo primario es viejo o no bueno

- las fosfoproteínas necesitan generalmente la incubación primaria de noche del anticuerpo

- no bastante anticuerpo secundario

- sobre-bloqueando

- los reactivo que se convierten son malos/usted incurrieron en una equivocación al prepararlas

Soluciones a la señal baja o a la señal débil:

- cargue más muestra de la proteína sobre el gel

- anticuerpo primario fresco del intento

- incube el overnite primario del anticuerpo para las fosfoproteínas en 4 grados de C (la coctelera de la cámara fría)

- aumente la concentración de proteína (lyse las muestras en menos almacenador intermediario de la lisis)

- disminuya la concentración de agente de bloqueo

- controle los reactivo que se convierten; prepare el ECL y el re-ECL frescos la membrana

- aumente la concentración o la longitud del período de incubación primario del anticuerpo

- aumente la concentración o la longitud del período de incubación secundario del anticuerpo

- manchada vendas debido al gel caliente

- borroso de las vendas debido al alto voltaje

Soluciones a las vendas borrosas y a las vendas Un-sharp:

- disminuya el voltaje o actual, ejecútese en cámara fría, y prepare el nuevo almacenador intermediario corriente. (el calor hace el gel perder su rigidez y su potencia de resolución)

- pre-remoje la membrana de la transferencia en la solución apropiada de la transferencia (determinada por el fabricante de la membrana) para la longitud del tiempo requerida.