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Manchas blancas /negras Occidentales De Localización de averías

  La guía molecular de la estación a los problemas y a las soluciones que borran occidentales: ¡Problemas y soluciones occidentales comunes de la mancha blanca /negra para ellos!

Éntrenos en contacto con por favor con sus ideas si usted puede agregar a esta guía.

 

¿Cuál es su problema occidental de la mancha blanca /negra? - Ordenado Alfabéticamente

Vendas Borrosas

Señal Baja

La membrana está brillando intensamente en el cuarto oscuro

Alto Fondo

Puntos en la película

También muchas vendas en mancha blanca /negra occidental

Señal Débil

 

 

Problema Occidental De Localización de averías De las Manchas blancas /negras:

Puntos en la película (vendas que faltan) :

- transferencia de los pobres debido a las burbujas de aire durante transferencia a la membrana

- película sucia al agregar al revelador

- los rodillos de revelador son sucios

Solución a los puntos en la película:

- utilice una pipeta del pasteur como rodillo del rodillo la membrana y el gel antes de transferencia para quitar la membrana y los materiales del mantiene de las burbujas mojados.

- mantenga la película limpia antes de agregar al revelador

 

Problema Occidental De Localización de averías De las Manchas blancas /negras:

También muchas vendas en mancha blanca /negra occidental:

- generalmente debido a muchas vendas no específicas

- calidad primaria pobre del anticuerpo o viejo anticuerpo

- no bastante bloqueando

- hendidura proteolytic del antígeno - todas las vendas adicionales son un MW más bajo que su proteína, (se está detectando pero fue degradado el IE su proteína)

Soluciones también a muchas vendas en mancha blanca /negra occidental:

- compre otro anticuerpo o substitúyalo por una acción fresca del anticuerpo

- bloque con leche sin materias grasas seca del 5% o BSA antes de la adición primaria. Si usted está bloqueando ya, considere el bloquear durante incubaciones primarias y secundarias del anticuerpo y también el aumentar bloqueando la leche o la concentración de BSA.

- guarde todo en el hielo, utilice las muestras frescas, salve adentro - 80C, y utilice los inhibidores del protease tales como PMSF

 

Problema Occidental De Localización de averías De las Manchas blancas /negras:

Alto fondo; relación de transformación baja de la señal/interferencia en mancha blanca /negra occidental

- negro o cada película oscura; la película era demasiado larga expuesto

- el bloqueo era escaso; el atascamiento no específico del anticuerpo primario y los anticuerpos secundarios no fueron lavados totalmente

- el lavado era escaso

¡- la película brilla intensamente en obscuridad! - dilusiones secundarias o primarias demasiado altas

Soluciones a la película oscura:

- exposición por menos tiempo, tiempo de la exposición de la disminución

- aumente el bloqueo de la duración de la incubación seca sin materias grasas de la leche el 5% o aumente la concentración.

- también usted puede intentar bloquear con el suero entero del animal del ordenador principal con (o antes) el anticuerpo secundario

- aumente las épocas que se lavan y los volúmenes a la ayuda quitan cualquier señal no específica debido al atascamiento débil del anticuerpo.

¡- usar un detergente más fuerte para lavarse - en vez de TBST (Tween-20), para utilizar detergentes más fuertes tales como NP-40 o SDS que puedan proporcionar a una colada más rigurosa y reducir el fondo (hace esto solamente si usted congriega es fuerte! - el lavarse también quita alguna su venda del interés!)

- concentración secundaria muy alta del anticuerpo (o aún primario) - realice los experimentos de la optimización para determinar dilusiones apropiadas del anticuerpo diluyen los anticuerpos más lejos.

 

Problema Occidental De Localización de averías De las Manchas blancas /negras:

Señal baja o señal débil

- debido a no bastante proteína cargó en el gel

- el anticuerpo primario es viejo o no bueno

- los phospho-proteins necesitan generalmente la incubación primaria de noche del anticuerpo

- no bastante anticuerpo secundario

- sobre-bloqueando

- los reactivo que se convierten son malos/usted incurrieron en una equivocación al prepararlos

Soluciones a la señal baja o a la señal débil:

- cargue más muestra de la proteína sobre el gel

- anticuerpo primario fresco del intento

- incube el overnite primario del anticuerpo para los phosphoproteins en 4 grados de C (coctelera de la cámara fría)

- aumente la concentración de la proteína (lyse las muestras en menos almacenador intermediario del lysis)

- disminuya la concentración del agente de bloqueo

- controle los reactivo que se convierten; prepare el ECL fresco y re-ECL la membrana

- aumente la concentración o la longitud del período primario de la incubación del anticuerpo

- aumente la concentración o la longitud del período secundario de la incubación del anticuerpo

 

Vendas borrosas, vendas manchadas, vendas no sostenidas

- manchada vendas debido al gel caliente

- borroso de las vendas debido al alto voltaje

Soluciones a las vendas borrosas y a las vendas un-sharp:

- disminuya el voltaje o actual, ejecútese en cámara fría, y prepare el nuevo almacenador intermediario corriente (el calor hace el gel perder su rigidez y su potencia de resolución)

- pre-remoje la membrana de la transferencia en la solución apropiada de la transferencia (determinada por el fabricante de la membrana) para la longitud del tiempo requerida.