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Protocolos De la Inmunoprecipitación

 

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Purificación De la Proteína

Estación Molecular Del Copyright 2006

La purificación de la proteína es vital en la caracterización de su proteína del interés. La purificación de su proteína permite que uno estudie la función de la proteína, y su actividad enzimática. La información de Stuctural de la proteína se puede también obtener de las proteínas purificadas incluyendo NMR, información 3-D tal como cristalización de la proteína.

¿Tan cómo uno va sobre la purificación de una proteína?

Las proteínas se pueden purificar según talla, solubilidad, carga y afinidad obligatoria

Las proteínas se pueden visualizar y distinguir fácilmente por métodos del electrophoresis.  Las técnicas del gel de las tesis se pueden también utilizar para obtener las cantidades pequeñas (microgramos) de polipéptidos purificados.  Sin embargo, no proporcionan a cantidades grandes de proteínas purificadas en su estado nativo.  Las cantidades substanciales de proteínas purificadas, de la orden de muchos miligramos, son necesarias aclarar completamente su estructura tridimensional y su mecanismo de la acción.  Vario mil proteínas se han purificado en forma activa en base de las características tales como talla, solubilidad, carga y afinidad obligatoria específica.  En cada paso de progresión en la purificación, la preparación se prueba para una característica distintiva de la proteína del interés (e.g. actividad enzimática) de evaluar la eficacia del procedimiento.

Las proteínas se pueden separar de las moléculas pequeñas por la diálisis a través de una membrana semipermeable, tal como membrana de la celulosa con los poros.  Las moléculas que tienen dimensiones perceptiblemente mayores que el diámetro del poro se conservan dentro del bolso de la diálisis, de las moléculas de los wwhereas y de los iones más pequeños de través los poros de tal membrana y emergen en la diálisis fuera del bolso.

Una separación más discriminatoria en base de la talla se puede alcanzar por la técnica de la cromatografía de la gel-filtracio'n.  La muestra se aplica a la tapa de la columna que consiste en los granos porosos hechos de un insoluble pero polímero altamente hidratado tal como dextran o agarose (que sean carbohidratos) o polyacrylamide.  Sephadex, el sepharose, y el biogel son comúnmente preparaciones comerciales usadas de estos granos, que son típicamente 100 micrómetros en diámetro.  Las moléculas pequeñas pueden entrar en estos granos pero los grandes no pueden.  El resultado es que las moléculas pequeñas están distribuidas en la solución acuosa dentro de los granos y entre ellos, mientras que las moléculas grandes están situadas solamente en la solución entre los granos.  Las moléculas grandes fluyen más rápidamente a través de esta columna y emergen primero, porque un volumen más pequeño es accesible a ellas.  Debe ser observado que la orden de la aparición de moléculas de una columna de granos porosos es el revés de la orden en el electrophoresis del gel, en el cual un marco continuo del polímero impide el movimiento de moléculas grandes.  Cantidades mucho más grandes de proteína se pueden separar por cromatografía de la filtración de gel que por electrophoresis del gel pero en el precio de una resolución más baja.

La solubilidad de la mayoría de las proteínas se baja en las altas concentraciones de la sal.  Este efecto, llamado salazón, es muy útil, aunque no bien entendida.  La dependencia de la solubilidad de la concentración de la sal diferencia a partir de una proteína a otra.  Por lo tanto la salazón se puede utilizar para fraccionar las proteínas.  La salazón es también útil para concentrar soluciones diluidas de proteínas.

 

 

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