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Protocolo Que borra Occidental

Occidental-borre el protocolo

Preparación de las muestras para el electrophoresis del gel de SDS-PAGE de la célula preparada Lysates

1. Prepare los geles para SDS-PAGE
2. Prepare el almacenador intermediario corriente del 1X
3. Agregue 50 ml de beta-beta-mercaptoethanol al almacenador intermediario de la muestra de 950 ml (para 1 ml). (solamente si usted pre-no ha agregado el beta-beta-mercaptoethanol al almacenador intermediario de la muestra)
4. Agregue el almacenador intermediario de la muestra a cada muestra (predetermine cuánto muestra usted puede cargar por receptor de papel - los peines de BioRad pueden conservar delgadamente sobre 30uL. Los peines grandes conservan el accomate hasta 50uL).
5. Muestras del vórtice abreviadamente.
6. Empuje un agujero en casquillo de cada tubo (prevenir las tapas haciendo estallar al hervir)
7. Ebullición en baño de la calefacción block/water en (95°C) por 5 minutos (temperaturas más bajas se han mostrado para prevenir la agregación no específica de la proteína)

Después de hervir muestras de la proteína - cargamento y funcionamiento el gel de SDS-PAGE

1. Centrifugue las muestras para 1 minuto en la velocidad.
2. Cargue la muestra en cada carril.
3. Cargue la referencia del MW (escala del peso molecular) (usted puede desear
4. Ejecute el gel en 100V (100V con empilar el gel, voltaje se puede aumentar hasta 200V al ejecutarse en la separación del gel con un montón de almacenador intermediario corriente)

Transferencia de las muestras de la proteína a la membrana

1. Prepare el almacenador intermediario de la transferencia del 1X
2. Remoje y sacudara el gel en el almacenador intermediario de la transferencia por 15 minutos
3. Remoje la membrana de la nitrocelulosa (o PVDF) y el papel de filtro (extraordinariamente grueso) por varios minutos.
4. Coloque el emparedado en la célula de la transferencia:

CLARO grueso adicional del papel de filtro
Membrana
Gel
NEGRO grueso adicional del papel de filtro

5. Transferencia eléctrica: ¡overnite 35V o 90V para 1 hora dependiendo de la talla de su proteína o de su paciencia!

Protocolo que borra occidental o Immunoblotting

1. Prepare el 1X TBST de las soluciones comunes.
2. Prepare el bloqueo del almacenador intermediario (albúmina del suero vacuno del 3% o leche del Borrar-grado del 5% (Blotto) en TBST). (usted puede desear intentar varias diversas veces y condiciones de bloqueo).
3. Lave la membrana en el 1X TBST con sacudarir por 10 minutos.
4. Bloque en la temperatura ambiente para 1 hora con el bloqueo del almacenador intermediario (el sacudarir o rotor circular)
5. Incube su membrana (PVDF o nitrocelulosa) con el anticuerpo primario de 1° Ab durante la noche (para borrar difícil condiciona el phosphorylation del IE de proteínas) o 1 hora para (las condiciones fáciles tales como proteína total) en 4°C (overnite) o la temperatura ambiente (incubación de 1 hora solamente) cubierta con el abrigo de saran (el sacudarir apacible). Usted puede utilizar las tinas plásticas del almacén del dólar para esto (utilice éstos solamente para borrar!) o fondos del rectángulo de la pipeta del uso. La dilusión para el anticuerpo primario es alrededor 1:1000. Vea las instrucciones del fabricante.
6. Lávese con el 1X TBST  3 x 15 minutos
7. Incube su membrana (PVDF o nitrocelulosa) con el anticuerpo secundario, 2° Ab por 30 – 45 minutos o (1 hora - para las condiciones que borran difíciles) en la temperatura ambiente. La dilusión para los anticuerpos secundarios es generalmente 1:10,000 o más alta. (IE 1uL de secundario en 10mL de TBST por la membrana) vea las instrucciones del fabricante.  Usted puede desear agregar su anticuerpo a bloquear la solución para disminuir el atascamiento no específico especialmente si usted consiguió el alto fondo en su primer experimento.
8. Colada con TBST   4-5 x 10 minutos. Éste es el paso de progresión que se lava más importante.
9. Ecl (los 5min)
10. Exposición a la película. El tiempo de la exposición de manchas blancas /negras occidentales es generalmente cerca de 10-30 segundos. Más de largo (5-10 minutos) para el phosphorylation. Si usted tiene una señal realmente débil, usted necesita cargar más proteína o el intento para aumentar el tiempo de la exposición (hasta 30 minutos - usted puede intentar dejarlo en un casette más largo).
11. ¡Guarde su membrana! Usted puede mantener su membrana 1X de TBST en el refrigerador por un rato. Usted puede necesitarlo por las razones siguientes: 1) controlar el cargamento (los revisores de papel pueden pedir proteína total o un estándar del cargamento tal como actinia). También, usted puede sondar inicialmente para un phospho-protein y después eliminar y el reprobe para la proteína total.

También vea nuestro protocolo que elimina occidental de la membrana que borra