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Protocolo Del Análisis De la Proteína De Lowry

Determinación de la concentración de la proteína por el protocolo del análisis de Lowry Prtoein

Materiales

1. Complejo-formacio'n del reactivo: Prepárese inmediatamente antes de uso mezclando las soluciones comunes siguientes en la proporción 100:1:1 (por el vol.), respectivamente:
            Solución A: el 2% (w/v) Na2CO3 en agua destilada.
            Solución B: el 1% (w/v) CuSO4·5H2O en agua destilada.
            Solución C: tartrato del potasio del sodio del 2% (w/v) en agua destilada.

2. Prepare El NaOH De 2 N.

3. Reactivo del folin (comercialmente disponible): Uso en 1 concentración de N.

4. Estándares: Utilice una solución común de la proteína estándar (e.g., fracción de la albúmina del suero vacuno V) que contiene la proteína de 2 mg/mL en el agua destilada, salvada congelado en –20°C. Prepare los estándares diluyendo la solución común con agua destilada como sigue:

Almacene la solución   (µL)     0         2.5      5          12.5     25        50        125      250      500

Agua                (µL)     500      498     495      488      475      450      375      250      0
Proteína concentrada.    (µg/mL) 0          10       20        50        100      200      500      1000    2000

Método

1. A 0.1 ml de muestra o estándar, agregue 0.1 ml de NaOH de 2 N. Hidrolice en 100°C por 10 minutos en un bloque de la calefacción o un baño de agua hirviendo.

2. Refresque el hydrolysate a la temperatura ambiente y agregue 1 ml de mezclado recientemente complejo-formando el reactivo. Deje la solución estar parada en la temperatura ambiente por 10 minutos.

3. Agregue 0.1 ml de reactivo del folin, usando un mezclador del vórtice, y deje el soporte de la mezcla en la temperatura ambiente por 30–60 minutos (no exceda 60 minutos).

4. Lea la absorbencia en 750 nm si la concentración de la proteína estaba debajo de 500 µg/mL o en 550 nm si la concentración de la proteína estaba entre 100 y 2000 µg/mL.

5. Trace una curva estándar de la absorbencia en función de la concentración inicial de la proteína y utilícela para determinar las concentraciones desconocidas de la proteína.

Referencias Del Método De Lowry

De acuerdo con protocolo por Jakob H. Waterborg.

Lowry et al. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

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