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Inmunoprecipitación

La inmunoprecipitación es una técnica que utiliza los anticuerpos específicos a una proteína para quitar esas proteínas de la solución. Los complejos de la anticuerpo-protei'na se precipitan fuera de la solución con la adición de una forma insoluble de proteínas obligatorias del anticuerpo. Los ejemplos incluyen la proteína A, la proteína G, Zysorbin, Immunoprecipitin, o la adición de un segundo anticuerpo a la solución (véase el diagrama 1 abajo).

Índice de la inmunoprecipitación

1. Fondo De la Inmunoprecipitación
2. Almacenadores intermediarios De la Inmunoprecipitación
3. Asuntos Recientes De la Inmunoprecipitación
4. Protocolos De la Inmunoprecipitación
5. Boletín de noticias De la Inmunoprecipitación
6. Artículos De la Inmunoprecipitación
7. Localización de averías De la Inmunoprecipitación

Diagrama 1.

Las muestras se pueden entonces lavar después de la precipitación y de la centrifugación. Los precipitados se pueden entonces ejecutar en los geles de SDS-PAGE con el almacenador intermediario de la muestra de la proteína. Las muestras de la proteína son generalmente radiactivas antes de lysis de la célula. Esto es hecha generalmente agregando los aminoácidos radiactivos a las células. Esto hace cosas simples mientras que la proteína entonces se detecta fácilmente en la película cuando está ejecutada en un gel como el punto emitirá la película de la radiactividad y de la exposición. Usted puede entonces evaluar para la talla de la proteína (en peso molecular con la comparación para clasificar estándares), y la cantidad (comparando muestras tratadas o a un estándar de cantidades).

Por otra parte, el procedimiento de la inmunoprecipitación también permite la concentración de las proteínas que no son muy abundantes o difíciles de detectar con la mancha blanca /negra occidental. El IP puede concentrar las proteínas hasta 10,000-fold mientras que puede tomar volúmenes grandes de lysates de la célula y concentrar su proteína del interés en un precipitado pequeño que se pueda entonces utilizar para el análisis occidental de la mancha blanca /negra u otros métodos.

 

Aplicaciones de la inmunoprecipitación:

1) la determinación del peso molecular y de la cantidad de immunoprecipitated la proteína de SDS-PAGE.

2) la inmunoprecipitación se utiliza para evaluar para las interacciones de la protei'na-protei'na. Esto es hecha la inmunoprecipitación para una proteína, y después borrando para otra proteína.

3) cuantificación del índice de la síntesis de una proteína en células determinando la proteína radiactiva de la cantidad hecha durante una cantidad de tiempo específica.

4) la inmunoprecipitación permite a la concentración de las proteínas que son de otra manera difíciles de detectar.

 

El método de la inmunoprecipitación se puede dividir en varios pasos de progresión:

1. Preparación de la muestra y lysis de la célula
2. Preclearing de la solución
3. Incubación con el anticuerpo y la formación de los complejos del anticuerpo-anti'geno
4. Precipitación del complejo del interés
5. Lavado de los complejos del anticuerpo-anti'geno para quitar las proteínas y los contaminantes no específicos.
6. Análisis de complexes/antigen del interés de SDS-PAGE

Protocolos De la Inmunoprecipitación	Directorio del protocolo de la inmunoprecipitación (conexiones externas)	Localice averías La Inmunoprecipitación	Aprenda sobre la inmunoprecipitación

Preparación de la muestra de la inmunoprecipitación y lysis de la célula

 

Almacenadores intermediarios Del Lysis De la Inmunoprecipitación

Dependiendo de la aplicación de la inmunoprecipitación o del IP, usted deseará utilizar diversos almacenadores intermediarios del lysis.  La opción del almacenador intermediario del lysis es importante y es dependiente en las características de la proteína del interés.

Si desee estudiar el phosphorylation de proteínas o de interacciones de la protei'na-protei'na, usted debe intentar Np-40.

Si usted está estudiando niveles de la proteína total de una proteína, usted debe intentar RIPA.

El almacenador intermediario de RIPA da un fondo más bajo en la inmunoprecipitación. Sin embargo, RIPA puede desnaturalizar algunas proteínas. Si usted está conduciendo la inmunoprecipitación experimenta para estudiar las interacciones de la protei'na-protei'na, RIPA no debe ser utilizada mientras que puede interrumpir interacciones de protein:protein.

El almacenador intermediario NP-40 tiene un nivel deanturing más bajo, y se utiliza así para los experimentos del phosphorylation tales como mirar actividad del kinase. También NP-40 se utiliza para las interacciones de la protei'na-protei'na. NP40 es un detergente no iónico, y es el detergente lo más comúnmente posible usado de los almacenadores intermediarios del lysis de la célula para la inmunoprecipitación y la mancha blanca /negra occidental.

Almacenador intermediario Del Lysis De la Célula de RIPA - Receta Del Almacenador intermediario De la Inmunoprecipitación

• 50 milímetros Tris-HCl
• Ajuste a pH 7.4
• 150 milímetros de NaCl
• 1 milímetro PMSF
• EDTA de 1 milímetro
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• el 1% Tritón x-100
• deoxycholate del sodio del 1%
• 0.1% Sds

Almacenador intermediario Del Lysis De la Célula NP-40 - Receta Del Almacenador intermediario De la Inmunoprecipitación

• 50 milímetros de Tris-HCl de concentración del final
• 150 milímetros del NaCl de concentración del final
• Agregue el 1% NP-40
• Ajuste a pH 8.0

Pre-claro para la inmunoprecipitación

El paso de progresión preclear se hace generalmente para la inmunoprecipitación porque baja la cantidad de proteínas no específicas en el lysate de la célula. Además, el pre-claro también quita las proteínas que pueden tener interacciones no específicas posibles y una alta afinidad para la proteína A, proteína G, Immunoprecipitin, Zysorbin, o cualesquiera forma insoluble de proteína obligatoria del anticuerpo usted está utilizando a pull-down su anticuerpo. Algunos investigadores encuentran este paso de progresión innecesario y saltan este paso de progresión. Pre-claro del intento la primera vez que usted intenta la inmunoprecipitación. Si sus resultados están absolutamente claros, intente saltar el experimento siguiente del pre-claro y vea cómo resulta.

 

IP: Anticuerpo de la incubación y formación de los complejos del Anticuerpo-Anti'geno

¿Qué anticuerpo debe usted utilizar para la inmunoprecipitación? Los anticuerpos de Polyclonal se utilizan generalmente para el immunoprecipation.

 

Inmunoprecipitación - precipitación del complejo del interés

Los complejos del anticuerpo-anti'geno no son insolubles por sí mismos, inmunoprecipitación del IE, no son una idea completa. Los anticuerpos y su atascamiento a los antígenos son solubles en la sangre, almacenadores intermediarios, y durante el experimento de la inmunoprecipitación.  Qué se utiliza para precipitarse fuera de estos complejos es proteínas obligatorias del anticuerpo insoluble. Las proteínas A y G, fueron aisladas de bacterias, y de lazo a la región constante del anticuerpo.

Los ejemplos de las proteínas obligatorias del anticuerpo insoluble precipitaban complejos en la inmunoprecipitación son:

• Proteína A
• Proteína G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Inmunoprecipitación - Pasos de progresión Que se lavan

  Lavar los complejos se hace usando RIPA, PBS, IP-LAVA el almacenador intermediario, u otros almacenadores intermediarios dependiendo de lo que usted quisiera analizar después del IP. El almacenador intermediario de RIPA es más riguroso mientras que PBS es menos riguroso.

Receta Del Almacenador intermediario De la Colada del IP

• el 10mM Tris; Ajuste a pH 7.4
• EDTA del 1mM
• el 1mM EGTA; pH 8.0
• NaCl del 150mM
• el 1% Tritón X-100
• sodio de los 0.2mM ortho-vanadate-vanadate
• coctel del inhibidor del protease

 

Notas finales para la inmunoprecipitación

  El éxito de la inmunoprecipitación es dependiente en la afinidad del anticuerpo para su antígeno.  Un buen anticuerpo de la inmunoprecipitación le dará el fondo bajo cuando usted analiza las muestras usando otras técnicas después del IP.  Las proteínas anticuerpo-que atan insolubles usadas son también muy importantes. Los anticuerpos de Polyclonal son los mejores anticuerpos para utilizar los anticuerpos monoclonal sin embargo purificados pueden también ser utilizados.  Controle a su vendedor del anticuerpo para ver si su anticuerpo monoclonal fue probado para la inmunoprecipitación.

 

Extremidades para la inmunoprecipitación

• Utilice los tubos de 2 ml para la inmunoprecipitación como se precipitan se lavan y se suspenden de nuevo más fácilmente
• Intente saltar el paso de progresión del pre-claro para salvar tiempo
• En vez de lavarse con IP-LAVE el intento PBS del almacenador intermediario
• Si usted tiene ya fondo bajo y su anticuerpo es grande, intente el IP que lava 2X en vez de 5X
• Se cerciora de usted quitar tanto líquido de los tubos del eppendorf cuando lavado de la inmunoprecipitación

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