Inmunoprecipitación

Las muestras se pueden entonces lavar después de la precipitación y de la centrifugación. Los precipitados se pueden entonces funcionar con en los geles de SDS-PAGE con el almacenador intermediario de la muestra de la proteína. Las muestras de la proteína son generalmente radiactivas antes de lisis de la célula. Esto es hecha generalmente agregando los aminoácidos radiactivos a las células. Esto hace cosas simples mientras que la proteína entonces se detecta fácilmente en la película cuando está ejecutada en un gel como el punto emitirá la película de la radiactividad y de la exposición. Usted puede entonces evaluar para la talla de la proteína (en peso molecular con la comparación para clasificar estándares), y la cantidad (comparando muestras tratadas o a un estándar de cantidades).

Por otra parte, el procedimiento de la inmunoprecipitación también permite la concentración de proteínas que no sean muy abundantes o difíciles de detectar usando mancha blanca /negra occidental. El IP puede concentrar las proteínas hasta el doblez 10.000 mientras que puede tomar volúmenes grandes de lysates de la célula y concentrar su proteína del interés en un pequeño precipitado que se pueda entonces utilizar para el análisis occidental de la mancha blanca /negra u otros métodos.

Aplicaciones de la inmunoprecipitación:

1) determinación del peso molecular y de la cantidad de proteína immunoprecipitated por SDS-PAGE.

2) la inmunoprecipitación se utiliza para evaluar para las interacciones de la proteína-proteína. Esto es hecha la inmunoprecipitación para una proteína, y después borrando para otra proteína.

3) cuantificación del índice de síntesis de una proteína en células determinando la proteína radiactiva de la cantidad hecha durante una cantidad de tiempo específica.

4) la inmunoprecipitación permite a la concentración de proteínas que sean de otra manera difíciles de detectar.

El método de la inmunoprecipitación se puede dividir en varios pasos de progresión:

Dependiendo de la aplicación de la inmunoprecipitación o del IP, usted querrá utilizar diversos almacenadores intermediarios de la lisis.  La opción del almacenador intermediario de la lisis es importante y es dependiente en las características de la proteína del interés.

Si quiera estudiar la fosforilación de proteínas o de interacciones de la proteína-proteína, usted debe intentar Np-40.

Si usted está estudiando niveles de la proteína total de una proteína, usted debe intentar RIPA.

• Tris-Ácido clorhídrico de 50 milímetros
• Ajuste a pH 7.4
• 150 milímetros de NaCl
• 1 milímetro PMSF
• EDTA de 1 milímetro
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• El 1% Tritón x-100
• Desoxicolato del sodio del 1%
• 0.1% SDS

• 50 milímetros de Tris-Ácido clorhídrico de concentración del final
• 150 milímetros del NaCl de concentración del final
• Agregue el 1% NP-40
• Ajuste a pH 8.0

El paso de progresión preclear se hace generalmente para la inmunoprecipitación porque baja la cantidad de proteínas no específicas en el lysate de la célula. Además, el pre-claro también quita las proteínas que pueden tener interacciones no específicas posibles y una alta afinidad para la proteína A, proteína G, Immunoprecipitin, Zysorbin, o cualesquiera forma insoluble de proteína obligatoria del anticuerpo usted está utilizando a pull-down su anticuerpo. Algunos investigadores encuentran este paso de progresión innecesario y saltan este paso de progresión. Pre-claro del intento la primera vez que usted intenta la inmunoprecipitación. Si sus resultados están absolutamente claros, intente saltar el experimento siguiente del pre-claro y vea cómo resulta.

¿Qué anticuerpo debe usted utilizar para la inmunoprecipitación? Los anticuerpos generalmente policlonales se utilizan para el immunoprecipation.

Los complejos del anticuerpo-antígeno no son insolubles solo, IE. la inmunoprecipitación, no es una idea completa. Los anticuerpos y su atascamiento a los antígenos son solubles en la sangre, almacenadores intermediarios, y durante el experimento de la inmunoprecipitación.  Qué se utiliza para precipitar hacia fuera estos complejos es proteínas obligatorias del anticuerpo insoluble. Las proteínas A y G, fueron aisladas de bacterias, y de lazo a la región constante del anticuerpo.

Los ejemplos de las proteínas obligatorias del anticuerpo insoluble usadas para precipitar complejos en la inmunoprecipitación son:

• Proteína A
• Proteína G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  Lavar los complejos se hace usando RIPA, PBS, IP-lava el almacenador intermediario, u otros almacenadores intermediarios dependiendo de lo que usted quisiera analizar después del IP. El almacenador intermediario de RIPA es más riguroso mientras que PBS es menos riguroso.

Receta del almacenador intermediario de la colada del IP

• 10mM Tris; Ajuste a pH 7.4
• EDTA 1mM
• 1mM EGTA; pH 8.0
• NaCl 150mM
• El 1% Tritón X-100
• orto-vanadate del sodio 0.2mM
• coctel del inhibidor de proteasa

Notas finales para la inmunoprecipitación

  El éxito de la inmunoprecipitación es dependiente en la afinidad del anticuerpo para su antígeno.  Un buen anticuerpo de la inmunoprecipitación le dará el fondo bajo cuando usted analiza las muestras usando otras técnicas después del IP.  Las proteínas anticuerpo-obligatorias insolubles usadas son también muy importantes. Los anticuerpos policlonales son los mejores anticuerpos para utilizar los anticuerpos monoclonales sin embargo purificados pueden también ser utilizados.  Controle a su vendedor del anticuerpo para ver si su anticuerpo monoclonal fue probado para la inmunoprecipitación.

Extremidades para la inmunoprecipitación

• Utilice los tubos de 2 ml para la inmunoprecipitación como los precipitados se lavan y se suspenden de nuevo más fácilmente
• Intente saltar el paso de progresión del pre-claro para salvar tiempo
• En vez de lavarse con IP-lave el intento PBS del almacenador intermediario
• Si usted tiene ya fondo bajo y su anticuerpo es grande, intente el IP que lava 2X en vez de 5X
• Cerciórese de le para quitar tanto líquido de los tubos del eppendorf cuando lavado de la inmunoprecipitación