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Protocolo De la Inmunoprecipitación

Inmunoprecipitación y protocolos.

IP Básico Del Protocolo De la Inmunoprecipitación:

1. Trate sus células

2. Coseche las células agregando 500 uL de solubilizar el almacenador intermediario, raspe y pase a través de la jeringuilla 21-gauge los tiempos de la aguja un X5 para homogeneizar.

3. Conduzca una precipitación del TCA (esto será utilizada para normalizar si usted radiactivo las células e.g. con S-35)

4. Pre-claro: Pre-claro agregando 2 uL de X, ratón o conejo o suero de la cabra (donde está la especie X animal en la cual el anticuerpo primario fue levantado) a las muestras enteras e incube en un rotor por 30 minutos en la temperatura ambiente.

5. Quite el suero de X incubando con immunoprecipitin de 30 uL con la rotación de 30 minutos en la temperatura ambiente.

6. Centrifugue las muestras por 3 minutos en 13, 000 RPM.

7. Después de la centrifugación, agregue 5 uL del anticuerpo primario (proteína específica anti-Y de X, donde está el anticuerpo Y levantado en un animal para su proteína del interés) a los supernatants e incube durante la noche en 4 grados de C.

8. Agregue 100 uL del immunoprecipitin a las muestras. Usted puede utilizar alternativomente Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin requiere algunos cambios de menor importancia al protocolo)

9. Centrifugadora en 13, 000 RPM por 3 minutos. Quite el supernatant.

10. Lave la pelotilla 3 X con 1 ml de almacenador intermediario frío de la colada del IP (agregue los inhibidores del protease al almacenador intermediario del wah antes del uso) con sacudarir por 5-10 minutos entre cada colada.

11. Utilice esta pelotilla para ejecutarse en un gel de SDS-PAGE. Usted puede agregar el almacenador intermediario de la muestra del SDS (almacenador intermediario del cargamento de la proteína) a este y la carga en el gel directamente después de hervir.

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