¡Recepción a la estación molecular!

Usted tiene que colocarse antes de que usted pueda fijar en nuestros foros o utilizar nuestras características avanzadas. ¡Registro Ahora! ¡Su libre y rápido!

¿Colocado ya? Conexión ahora abajo.

Nombre Del Utilizador:

Palabra de paso:

¿Recuérdeme?

¿Colocado ya y se olvidó de su palabra de paso? Tecleo abajo para recuperarla.

Recupere La Palabra de paso Perdida

¡Ahora ensamble - está rápida y libre!

¡La estación molecular es la red más grande de investigadores, de científicos y de amantes de la ciencia dondequiera!

Postes Recientes Del Foro

 

Protocolos De la Proteína

Enciclopedia De la Proteína

Proteína Bioinformatics

Foro De la Ciencia De la Proteína

Proteína Blog

Noticias de la DNA

 

Protocolo Del Análisis De la Proteína De Bradford

Concentración Determinatino de la proteína usando el método de comprobación de Bradford

Materiales para el análisis de Bradford

1. Reactivo: El reactivo del análisis es hecho disolviendo el magnesio 100 de Coomassie G250 azul en 50 ml de etanol del 95%. La solución después se mezcla con 100 ml de ácido fosfórico del 85% y se compone a 1 L con agua destilada. El reactivo se debe filtrar a través del papel de filtro de Whatman No. 1 y después salvar en una botella ambarina en la temperatura ambiente. Es estable por varias semanas. Sin embargo, durante este tiempo el tinte puede precipitarse de la solución y así que el reactivo salvado se debe filtrar antes de uso.

2. Estándar de la proteína. Bóvidos γ- la globulina en una concentración de 1 mg/mL (100 µg/mL para el microanálisis) en agua destilada se utiliza como solución común. Esto se debe salvar congelada en –20oC. Puesto que el contenido de agua de la proteína sólida puede variar durante almacenaje, la concentración exacta de la proteína en la solución de estándar se debe determinar de su absorbencia en 280 nm. La absorbencia de una 1 solución de mg/mL de γ- la globulina, en un camino ligero çenti'metro, es 1.35. Los valores correspondientes para dos estándares alternativos de la proteína, la albúmina del suero vacuno y el ovalbumin, son 0.66 y 0.75, respectivamente.

3. El plástico y la cristalería usados en el análisis deben ser absolutamente limpios y detergente libremente. Las cubetas del espectrofotómetro del cuarzo (silicona) no deben ser utilizadas, pues el tinte ata a este material. Los rastros del límite del tinte a la cristalería o al plástico pueden ser quitados aclarando con metanol o la solución detergente.

 Método De Comprobación Estándar De Bradford

1. Mida con una pipeta entre el µg 10 y 100 de la proteína en volumen total de 100 µL en un tubo de prueba. Si la concentración aproximada de la muestra es desconocida, pruebe un rango de las dilusiones (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepare los artículos con llave de validación de cada muestra.

2. Para la curva de calibración, mida con una pipeta los volúmenes duplicados 10, 20, 40, 60, 80, y 100 del µL de 1 mg/mL γ- solución de estándar de la globulina en los tubos de prueba, y haga cada uno hasta 100 µL con agua destilada. Mida con una pipeta el µL 100 del agua destilada en otro tubo para proporcionar al espacio en blanco el reactivo.

3. Agregue 5 ml de reactivo de la proteína a cada tubo y mézclese bien por la inversión o trate vortexmixing con suavidad. Evite de hacer espuma, que conducirá a la reproductibilidad pobre.

4. Mida el A595 de las muestras y de los estándares contra el espacio en blanco el reactivo entre 2 minutos y 1 h después de mezclarse. El estándar de 100 µg debe dar un valor A595 de cerca de 0.4. La curva estándar no es linear, y la absorbencia exacta varía dependiendo de la edad del reactivo del análisis. Por lo tanto, es esencial construir una curva de calibración para cada conjunto de análisis.

El método del microanálisis esta forma del análisis es más sensible a la proteína. Por lo tanto, es útil cuando la cantidad de la proteína desconocida se limita (véase también la nota 9). 1. Mida con una pipeta las muestras duplicadas que contienen entre el µg 1 y 10 en un volumen total del µL 100 en los tubos del microfuge del polietileno 1.5-mL. Si la concentración aproximada de la muestra es desconocida, pruebe un rango de las dilusiones (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. Para que haya la curva de calibración, mida con una pipeta los volúmenes duplicados 10, 20, 40, 60, 80, y 100 del µL de 100 µg/mL γ- solución de estándar de la globulina en los tubos del microfuge, y ajuste el volumen al µL 100 con agua. Mida con una pipeta el µL 100 del agua destilada en un tubo para el espacio en blanco el reactivo.

3. Agregue 1 ml de reactivo de la proteína a cada tubo y mézclese suavemente, pero a conciencia.

4. Mida la absorbencia de cada muestra entre 2 y 60 minutos después de la adición del reactivo de la proteína. El valor A595 de una muestra que contiene el µg 10 γ- la globulina es 0.45.

vea también: Análisis De la Proteína De Bradford

Referencias para el análisis de Bradford

Modificado de protocolo por Nicholas J. Kruger.

Artículos Relacionados De la Concentración De la Proteína

Concentración De la Proteína

Protocolo De la Concentración De la Proteína

Análisis De la Proteína De Lowry

Protocolo Del Método De Lowry

Método De Bradford

Otros Métodos De la Proteína:

Mancha blanca /negra Occidental

Inmunoprecipitación