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Métodos y análisis de detección del Microarray de la proteína

Microarrays de la proteína y del anticuerpo

Métodos y análisis de detección para las virutas de la proteína y del anticuerpo

Métodos de detección y atascamiento no específico
            El atascamiento no específico al arsenal necesita ser reducido al mínimo y esto es hecha típicamente sumergiendo las matrices en un almacenador intermediario basado albúmina del suero vacuno (BSA) (31).
            el Analito-atar y la retención en matrices de la proteína procede vía el mecanismo obligatorio termodinámico conducido similar al hibridación de las blancos del ácido nucléico a las puntas de prueba.  Sin embargo, la detección de blancos encuadernadas a las proteínas es considerablemente más compleja que la de la detección del microarray de la DNA (9).  Una variedad de métodos de detección se están examinando actualmente.  Por ejemplo, ELISA primero fue utilizado para detectar las proteínas para las matrices del filtro (66.67) y las matrices del vidrio (68).  Los métodos de detección basados ELISA tienen la desventaja de la no-especificidad de las interacciones del proteína-anticuerpo, llevando a muchos positivos falsos.   El etiquetado del radioisótopo fue utilizado por la GE y otros (22), radioisótopo que etiquetaba para estudiar la proteína-proteína, proteína-DNA, interacciones de la proteína-droga en matrices del filtro.  Zhu y otros utilizó el radioisótopo que etiquetaba para conducir análisis de la cinasa de diversos substratos usando las proteínas purificadas de la cinasa de la levadura en un arsenal (36).  El método preferido de detección es detección de la fluorescencia porque estos métodos son generalmente seguros, extremadamente sensible, simple y puede tener mismo alta resolución.  Estos métodos de detección son también compatibles con los exploradores estándar del microarray. Generalmente, una viruta es cualquiera sondada directamente con una molécula fluorescente (e.g. una proteína fluorescente etiquetada o una pequeña molécula, usando una punta de prueba marcada con etiqueta (e.g. biotina), que se puede entonces detectar en un segundo paso de progresión usando un reactivo fluorescente etiquetado de la afinidad (e.g. streptavidin) (16.56). Otro método de etiquetado fluorescente es la amplificación del círculo de balanceo (RCA), que es también extremadamente sensible (32).  
            Aunque los proteomes bajo comparación se puedan etiquetar en una manera comparable con los fluorophores, la reproductibilidad de estas reacciones químicas es pobre e interferencia con los presentes de las interacciones del proteína-anticuerpo una complejidad adicional (9). También, el etiquetado no uniforme de proteínas puede ser tratado realizando un análisis radiométrico del dual-color, donde está presente un estándar interno para cada proteína de la blanco que se mida (9).          Una desventaja de proteínas de etiquetado con los fluorophores es una reducción de la exactitud cuantitativa del análisis, pues la incorporación de la escritura de la etiqueta puede alterar las características obligatorias de las proteínas (9).

Aunque los métodos de detección de etiquetado de la proteína directa sean todavía ampliamente utilizados, los problemas intrínsecos mencionados han dado lugar al uso cada vez mayor de los métodos de detección de la escritura de la etiqueta libremente para los microarrays de la proteína.  Estos métodos son la espectrometría total (ms), la microscopia atómica de la fuerza (AFM) (70), y la resonancia superficial del plasmón (SPR) (71). 
los métodos de No-etiquetado tienen ventajas como acercamiento directo de la detección para los microarrays del anticuerpo puesto que el etiquetado de las moléculas afecta a actividad de la proteína. La espectrometría total de SELDI (desorción superficie-realzada/ionización del laser) se ha utilizado para detectar las matrices de baja densidad de las proteínas capturadas (69). Las proteínas se capturan en un arsenal de superficie de metal (arsenal de la proteína de SELDI) y se vaporizan usando un de rayo láser.  El análisis usando datos de la espectrometría total entonces se realiza para revelar las identidades de estas proteínas.

            Cambios topológicos de la fuerza de la microscopia (AFM) del método de la superficie atómica de las aplicaciones para identificar las proteínas capturadas en un arsenal del anticuerpo (70).  Cuando el conejo IgG se inmoviliza en una superficie del oro y ata a sus anticuerpos elogiosos, hormiga-conejo IgG, AFM de la cabra detecta el aumento en altura, y puede así medir el atar de interacciones.  No obstante para estudiar la cinética de las interacciones del antígeno-anticuerpo, los métodos de detección en tiempo real serán útiles.  La resonancia superficial del plasmón (SPR) se ha madurado en una herramienta versátil de la detección para estudiar la cinética de las interacciones del receptor-ligand con una amplia gama de los pesos moleculares, de las afinidades y de las tarifas obligatorias (72-74). Las virutas comerciales de SPR están disponibles sin embargo su resolución de la detección son limitadas.  Una superficie del sensor con 64 sitios individuales de la inmovilización en una sola célula de flujo fue desarrollada (75).  Un biosensor del arsenal del anticuerpo también fue desarrollado para estudiar la cinética del antígeno que ataba usando una guía de onda planar como el método de detección. Usando este método, el grupo demostró que la intensidad significativa de la señal se podría alcanzar de los puntos tan pequeños como 200 milímetros de diámetro. Por lo tanto se espera que este acercamiento sea conveniente para el alto-rendimiento de procesamiento y los estudios paralelos de la cinética. (76).

Rango de la detección
            Otra diferencia entre la proteína y los microarrays de la DNA es que las concentraciones de la proteína en una sola muestra biológica o células son varias pedidos del magnitute mayores que ésa para los mRNAs.  Así los sistemas del detector de viruta de la proteína deben tener un rango muy grande de la operación de la detección - hasta un factor de 1014, comparado a 104 para el mRNA.  Así un anticuerpo con afinidad nanomolar a una blanco determinada será saturado por la presencia de esta blanco en las concentraciones micromolar y no podrá detectar niveles femtomolar del pico- o de blanco.  Así acomodar las proteínas raras y abundantes requerirá probablemente las matrices separadas (7.8.9).
            Los anticuerpos múltiples con las afinidades diversas para la blanco se pueden colocar en diversas áreas de los estudios del arsenal sin embargo han mostrado que los solamente 20% de anticuerpos puestos en orden proporcionan a medidas de proteínas en las concentraciones bajas (33). 

Después: Producción de la proteína para las matrices de la proteína

Referencias para los Microarrays de la proteína y del anticuerpo

De nuevo a:

Introducción y fondo a las virutas de la proteína y a las virutas del anticuerpo.

Tipos de virutas del anticuerpo y de la proteína

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