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Proteína y anticuerpo Microarrays
Conexión
Para asociar las proteínas a una superficie
sólida, la superficie del substrato tiene que ser modificada para
alcanzar la capacidad de enlace máxima (8.27). Las
proteínas se asocian a la viruta en una capa de la conexión de la
proteína (véase el cuadro 3). Esta capa es típicamente
una película orgánica que varía con la naturaleza de la
aplicación. Una variedad de materiales se ha estudiado
incluyendo el agarose (39), el hydrogel dextran-basado (40), los
polímeros y los ácidos hidrofílicos del polyamino (41)
del hydrogel poroso del polyacrylamide.
Un método conveniente de la conexión utilizó la
nitrocelulosa-membrana o el poly-L-poly-L-Lysine cubrió el cristal
tales que las proteínas se podrían absorber pasivo sobre la
superficie con las interacciones no específicas (34.42.43). Las proteínas asociadas atan sobre la superficie en
orientaciones al azar y se pueden lavar apagado bajo condiciones que
se lavan rigurosas. Sin embargo, el nivel de ruidos es
generalmente más alto debido a el absorption/adsorption no
específico.
Una conexión más específica y más fuerte es alcanzada
creando superficies reactivas sobre el cristal que puede covalente
reticulación a las proteínas (31.36.26). Un
cross-linker del silane del bifunctional se utiliza para formar un
monolayer uno mismo-ensamblado (SAM), que tiene un grupo funcional que
reaccione con los grupos del oxhidrilo sobre el cristal la superficie
de cristal, y otro grupo que esté libre reaccionar con los grupos
primarios de la amina de proteínas o pueda ser más futuro
químicamente modificado a la especificidad máxima del alcance
(44.45). Otra variación es el cristal oro-revestido
(46.47). La ventaja de virutas oro-revestidas es que SPR
y el spectrometry total se pueden integrar como métodos de detección
para vigilar la dinámica de la reacción, e identificar las
moléculas capturadas.
Los acercamientos covalentes antedichos del cross-linking sin
embargo tienen una desventaja. debido al hecho de que los
ligands reactivos también existen en los encadenamientos laterales de
proteínas es posible que su conexión al azar puede alterar la
confirmación nativa de proteínas, reducir la actividad de
proteínas, o hacerlas inaccesibles a las puntas de prueba (8.27).
Para orientar las proteínas uniformily lejos de la superficie
de la viruta, las proteínas se pueden fundir con una etiqueta de la
alto-afinidad en sus términos amino o del carboxy. Con
este método, proteins/antibodies inmovilizados son más probables
permanecer en su conformación nativa, así no prohibiendo a los
analytes el acceso eficiente a los sitios activos de las proteínas. Este método era primer demostrado con éxito con la
conexión de 5800 proteínas de la fusión que contenían una su
etiqueta sobre una diapositiva de cristal ni'quel-revestida (26). Otros métodos de la afinidad tales como glutathione/GST
también se han utilizado (48).
Los métodos basados Streptavidin de la inmovilización también
se han empleado extensamente para asociar cualesquiera biotinylated el
elemento biológico a la superficie del arsenal (49).
El material de ayuda de la viruta es importante porque las
proteínas son altamente sensibles a las características
physiochemical. Por ejemplo, las matrices polares
químicamente se tratan para atar a las proteínas hidrofílicas sin
embargo que tales superficies son inadecuadas para las proteínas de
la membrana de la célula (e.g. receptores juntados G-protei'na) como
poseen dominios hidrofóbicos (9).
Las proteínas no se comportan como los ácidos nucleic, y
diversas proteínas se comportarán de diversas maneras cuando están
expuestas a la misma química superficial. Diversos
tipos las químicas superficiales promoverán así la retención de
algunas proteínas y causarán la desnaturalización o la pérdida de
actividad de otras. Por lo tanto, la opción apropiada
de la química superficial es actividad importante como ésta
permitirá que las proteínas inmovilizadas de tipos diversos
conserven sus estructuras secundarias y terciarias, y así su
biológica. Se magnifica este problema cuando el número
de diversos puntos en los aumentos de la viruta, como allí puede ser
100 diversas maneras de inmovilizar 100 diversas proteínas para
obtener el plegamiento y la función apropiados de todas las
proteínas. También un problema significativo está
porque las funciones de la mayoría de las proteínas son actualmente
desconocido, tan allí no es ningún método a probar realmente si
siguen siendo funcionales en la viruta (7).
Después: Métodos De la Salida De la Viruta De la Proteína
Referencias para la proteína y el anticuerpo Microarrays
De nuevo a:
Introducción y fondo a las virutas de la proteína y a las virutas del anticuerpo.
Tipos de virutas del anticuerpo y de la proteína
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