Condiciones acertadas de la polimerización en cadena

Parámetros para la polimerización en cadena acertada

¿Le tienen problemas de alcanzar de una polimerización en cadena acertada?  Muchos factores pueden afectar a su resultado de su polimerización en cadena por ejemplo: Cofactores del ion del metal, substrato y análogos del substrato, almacenadores intermediarios y sales y Cosolvents.  Consideraciones del ciclo también termal:  Recipientes de la polimerización en cadena, optimización de la temperatura y del tiempo, ciclos de la amplificación de la polimerización en cadena, enzima/blanco y comienzo caliente. 

Cofactores del ion del metal y polimerización en cadena

Un cofactor esencial para la polimerasa de DNA en la polimerización en cadena es cloruro del magnesio.  Su concentración se debe optimizar para cada cartilla: sistema del modelo. Muchos componentes del ion del magnesio del lazo de la reacción, incluyendo las cartillas, modelo, productos de la polimerización en cadena y dNTPs. El agente astringente del 1:1 principal para el ion del magnesio es la alta concentración de dNTPs en la reacción. Porque es necesario que el ion libre del magnesio sirva como cofactor de la enzima en la polimerización en cadena, la concentración total del ion del magnesio debe exceder la concentración total del dNTP. Típicamente, comenzar el proceso de la optimización, 1.5 milímetros de cloruro del magnesio se agregan a la polimerización en cadena en presencia de dNTPs totales de 0.8 milímetros. Esto deja cerca de 0.7 milímetros de magnesio libre para la polimerasa de DNA. El ion del magnesio se debe variar generalmente en una serie de la concentración a partir de 1.5-4.0 milímetros en pasos de progresión de 0.5 milímetros.

Substratos y análogos del substrato para la polimerización en cadena

Las polimerasas de DNA incorporan muy eficientemente dNTPs.  También pueden incorporar los substratos modificados, cuando se utilizan como componentes suplementales en la polimerización en cadena. Los ejemplos de los substratos usados para la polimerasa de DNA son: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, y dNTPs fluorescente etiquetados. Para la polimerización en cadena convencional, la concentración de dNTPs sigue siendo equilibrada en las relaciones de transformación equimolares, e.g., μM 200 cada dNTP. También observe eso, desviaciones de estas recomendaciones estándar puede ser beneficioso en ciertos amplications. Por ejemplo, cuando la mutagénesis al azar de una blanco específica se desea, las concentraciones desequilibradas del dNTP promueven un grado más alto de misincorporations por la polimerasa de DNA.

Almacenadores intermediarios y sales para la polimerización en cadena

Dependiendo de la polimerasa de DNA utilizó la concentración óptima del almacenador intermediario de la polimerización en cadena, concentración de la sal, y el pH se debe escoger por consiguiente a la polimerasa de DNA. El almacenador intermediario de la polimerización en cadena para la polimerasa de DNA de Taq consiste en 50 milímetros de KCl y Tris-Ácido clorhídrico de 10 milímetros, pH 8.3, en la temperatura ambiente. Este almacenador intermediario proporciona a la fuerza iónica y a la capacidad tapón necesarias durante la reacción. Es importante observar que la concentración de la sal afecta a TM de la cartilla: duplex del modelo, y por lo tanto la temperatura del recocido.

Cosolvents

Diversa polimerización en cadena Cosolvents se utiliza para aumentar la producción, la eficacia, y la especificidad de las amplificaciones de la polimerización en cadena. Estos cosolvents pueden ser ventajosos en algunas amplificaciones, y desventajosos en otras amplificaciones. Es imposible predecir qué añadido será útil para cada cartilla: el duplex del modelo y por lo tanto el cosolvent se debe empírico probar para cada combinación.

Consideraciones del ciclo termal

Recipientes de la polimerización en cadena

La polimerización en cadena se debe realizar en los recipientes que son compatibles con cantidades bajas de enzima y de ácidos nucléicos y que tienen buenas características de transferencia termales. Generalmente, el polipropileno se utiliza para los recipientes de la polimerización en cadena y los tubos convencionales, de pared gruesa del microcentrifuge se eligen para muchos sistemas termales del cycler. La polimerización en cadena se realiza en una escala de la reacción del μL 10-100 y requiere lo más a menudo posible la prevención de los procesos de la evaporación/de la condensación en el tubo cerrado de la reacción durante el ciclo termal. Una capa del recubrimiento o de la cera del aceite mineral responde a este propósito. Más recientemente, los recipientes de paredes delgadas 0.2-mL se han optimizado para el proceso de la polimerización en cadena y se han diseñado los cyclers termales sin aceite que utilizan una cubierta heated sobre los tubos sostenidos dentro del bloque de la muestra.

Optimización de la duración de la temperatura y de ciclo

Es esencial que las mezclas de reacción alcanzan la desnaturalización, el recocido, y las temperaturas de la extensión en cada ciclo termal. Si el tiempo de asimiento escaso se especifica en cualquier temperatura, la temperatura de la muestra no será equilibreada con la del bloque de la muestra. Un cierto cycler termal diseña tiempo que el intervalo del asimiento basó en la temperatura del bloque, mientras que otros basan el tiempo de asimiento en temperatura prevista de la muestra. Si un tubo de pared gruesa convencional usado en un cycler controlado por temperatura del bloque, un rato de asimiento de 60 s es suficiente para el equilibrio. El tiempo adicional se puede recomendar en (72°C) paso de progresión de la extensión para productos más largos de la polimerización en cadena. Usando un tubo de paredes delgadas 0.2-mL en un cycler controlado por temperatura prevista de la muestra, se requiere solamente 15 s. Para utilizar protocolos existentes o a los protocolos del desarrollo para el uso en los laboratorios múltiples, es muy importante elegir tiempos de asimiento según el espesor de pared del diseño y del tubo del cycler.

Número de ciclo de la amplificación de la polimerización en cadena

El número de ciclos de la amplificación de la polimerización en cadena se debe optimizar con respecto a la concentración que comienza de la DNA de la blanco. Se recomienda que, a partir del 40 - 45 ciclos para amplificar 50 moléculas de la blanco, y 25-30 completa un ciclo para amplificar 3 moléculas del × 105 a la misma concentración. Esta no-proporcionalidad es causada por un efecto supuesto de la meseta, en el cual una disminución del índice exponencial de acumulación del producto ocurre en últimas etapas de una polimerización en cadena. Esto se puede causar por la degradación de los reactivo (dNTPs, enzima); agotamiento el reactivo (cartillas, dNTPs); inhibición del producto final (formación del pirofosfato); competición para los reactivo por los productos no específicos; o competición para la cartilla que ata reannealing (10 nanómetro) del producto concentrado. Es generalmente recomendable funcionar con el número mínimo de ciclos necesarios para ver el producto específico deseado, porque interferirán los productos no específicos indeseados si el número de ciclos es excesivo.

 Enzima/blanco

En una parte alícuota estándar de la polimerasa de DNA de Taq usada para una reacción de 100 μL, hay cerca de 1010 moléculas. Cada muestra de la polimerización en cadena se debe evaluar para el número de copias de la blanco que contiene o que puede contener. Por ejemplo, 1 ng de DNA de la lambda contiene 1.8 copias del × 107. Para la polimerización en cadena del número de copia de la bajo-entrada de información, la enzima llega a ser limitadora y puede ser necesario dar al proceso de la extensión incremental más tiempo. Los cyclers termales pueden realizar confiablemente este procedimiento automático de la extensión del segmento para maximizar la producción de la polimerización en cadena.

Condiciones del comienzo caliente

Todas las optimizaciones antedichas también se aplican a una polimerización en cadena que se diseñe, del principio, con un método del comienzo caliente. A menudo, un comienzo caliente se puede incorporar con éxito en una polimerización en cadena previamente optimizada sin el cambio de las condiciones de la reacción. Sin embargo, paga generalmente reoptimize después de agregar un comienzo caliente. La optimización es a menudo un equilibrio entre producir tanto producto como sea posible y sobreproducir no específico, amplificaciones del fondo. Porque el comienzo caliente reduce grandemente amplificaciones del fondo, los alojamientos superiores se levantan en condiciones tales como concentración de la enzima, número de ciclo, y concentración del cofactor del ion del metal. PCRs sensible que se ha templado altamente sin un comienzo caliente puede fallar cuando se agrega un comienzo caliente. Esto se puede causar por retardos leves en los ciclos tempranos causados por la mezcla o la activación de la enzima. La polimerización en cadena se puede restablecer generalmente, a menudo con aumento substancial en producto específico, simplemente aumentando limitando parámetros o los reactivo. Además, hay optimizaciones específicas a cada método del comienzo caliente. La mezcla o la activación de la enzima se puede afectar por el volumen de la polimerización en cadena, la composición y pH, cosolvents, condiciones de ciclo del almacenador intermediario, y así sucesivamente. La literatura del producto específico, a menudo un separador de millares del producto, se debe consultar para la información sobre estas consideraciones.