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Condiciones Acertadas de PCR

Parámetros para PCR acertado

¿Le tienen problemas de alcanzar un PCR acertado?  Muchos factores pueden afectar su resultado de su PCR por ejemplo: Cofactores del ion del metal, substrato y análogos del substrato, almacenadores intermediarios y sales y Cosolvents.  Consideraciones Que completan un ciclo También Termales:  Recipientes de PCR, optimización de la temperatura y del tiempo, ciclos de la amplificación de PCR, Enzyme/Target y comienzo caliente. 

Cofactores del ion del metal y PCR

Un cofactor esencial para la polimerasa de la DNA en PCR es cloruro del magnesio.  Su concentración se debe optimizar para cada sistema de primer:template. Muchos componentes de la reacción atan el ion del magnesio, incluyendo las cartillas, modelo, productos de PCR y dNTPs. El agente astringente de 1:1 principal para el ion del magnesio es la alta concentración de dNTPs en la reacción. Porque es necesario que el ion libre del magnesio sirva como cofactor de la enzima en PCR, la concentración total del ion del magnesio debe exceder la concentración total del dNTP. Típicamente, comenzar el proceso de la optimización, 1.5 milímetros de cloruro del magnesio se agregan a PCR en la presencia de los dNTPs totales de 0.8 milímetro. Esto deja cerca de 0.7 milímetro de magnesio libre para la polimerasa de la DNA. En general, el ion del magnesio se debe variar en una serie de la concentración a partir de 1.5–4.0 milímetros en pasos de progresión de 0.5 milímetro.

Substratos y análogos del substrato para PCR

Las polimerasas de la DNA incorporan muy eficientemente dNTPs.  También pueden incorporar los substratos modificados, cuando se utilizan como componentes suplementales en PCR. Los ejemplos de los substratos usados para la polimerasa de la DNA son: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, y dNTPs fluorescently etiquetados. Para PCR convencional, la concentración del restos de los dNTPs balanceada en las relaciones de transformación equimolar, e.g., 200 μM que cada dNTP. también observa eso, desviaciones de estas recomendaciones estándares puede ser beneficiosa en ciertos amplications. Por ejemplo, cuando la mutagénesis al azar de una blanco específica se desea, las concentraciones desequilibradas del dNTP promueven un grado más alto de misincorporations por la polimerasa de la DNA.

Almacenadores intermediarios y sales para PCR

Dependiendo de la DNA la polimerasa utilizó la concentración óptima del almacenador intermediario de PCR, concentración de la sal, y el pH se debe escoger por consiguiente a la polimerasa de la DNA. El almacenador intermediario de PCR para la polimerasa de la DNA de Taq consiste en 50 milímetros de kCl y 10 milímetros Tris-HCl, pH 8.3, en la temperatura ambiente. Este almacenador intermediario proporciona a la fuerza iónica y a la capacidad tapón necesitadas durante la reacción. Es importante observar que la concentración de la sal afecta el Tm del duplex de primer:template, y por lo tanto la temperatura del recocido.

Cosolvents

Diversos PCR Cosolvents se utilizan para aumentar la producción, la eficacia, y la especificidad de las amplificaciones de PCR. Estos cosolvents pueden ser ventajosos en algunas amplificaciones, y desventajosos en otras amplificaciones. Es imposible predecir que qué añadido será útil para cada duplex de primer:template y por lo tanto el cosolvent debe empírico ser probado para cada combinación.

Consideraciones Que completan un ciclo Termales

Recipientes de PCR

PCR se debe realizar en los recipientes que son compatibles con cantidades bajas de enzima y de ácidos nucleic y que tienen buenas características termales de la transferencia. Generalmente, el polypropylene se utiliza para los recipientes de PCR y los tubos convencionales, thick-walled del microcentrifuge se eligen para muchos sistemas termales del cycler. PCR se realiza en 10 100 L–escala μde la reacción y requiere lo más a menudo posible la prevención de los procesos de evaporation/condensation en el tubo cerrado de la reacción durante completar un ciclo termal. Una capa del recubrimiento o de la cera del aceite mineral responde a este propósito. Más recientemente, los recipientes de paredes delgadas 0.2-mL se han optimizado para el proceso de PCR y se han diseñado los cyclers termales sin aceite que utilizan una cubierta calentada sobre los tubos sostenidos dentro del bloque de la muestra.

Optimización de la duración de la temperatura y de ciclo

Es esencial que las mezclas de reacción alcanzan la desnaturalización, el recocido, y temperaturas de la extensión en cada ciclo termal. Si el tiempo de asimiento escaso se especifica en cualquier temperatura, la temperatura de la muestra no será equilibreada con la del bloque de la muestra. Un cierto cycler termal diseña tiempo que el intervalo del asimiento basó en la temperatura del bloque, mientras que otros basan el tiempo de asimiento en temperatura predicha de la muestra. Si un tubo thick-walled convencional usado en un cycler controlado por temperatura del bloque, un rato de asimiento 60-s es suficiente para el equilibrio. La hora adicional se puede recomendar en el paso de progresión de la extensión (72°C) para productos más largos de PCR. Usando un tubo de paredes delgadas 0.2-mL en un cycler controlado por temperatura predicha de la muestra, se requiere solamente 15 s. Para utilizar protocolos existentes o a los protocolos del desarrollo para el uso en los laboratorios múltiples, es muy importante elegir tiempos de asimiento según el espesor de pared del diseño y del tubo del cycler.

Número Del Ciclo De la Amplificación de PCR

El número de los ciclos de la amplificación de PCR se debe optimizar con respecto a la concentración que comienza de la DNA de la blanco. Se recomienda que, a partir de 40– 45 ciclos para amplificar 50 moléculas de la blanco, y de 25–30 ciclos para amplificar 3 × 105 moléculas a la misma concentración. Esta no-proporcionalidad es causada por un efecto supuesto de la meseta, en el cual una disminución del índice exponencial de la acumulación del producto ocurre en últimas etapas de un PCR. Esto se puede causar por la degradación de los reactivo (dNTPs, enzima); agotamiento el reactivo (cartillas, dNTPs); inhibición del producto final (formación del pirofosfato); competición para los reactivo por los productos no específicos; o competición para la cartilla que ata reannealing (10 nM) del producto concentrado. Es generalmente recomendable ejecutar el número mínimo de los ciclos necesitados para ver el producto específico deseado, porque interferirán los productos no específicos indeseados si el número de ciclos es excesivo.

 Enzima/Blanco

En una parte alícuota estándar de la polimerasa de la DNA de Taq usada para 100-μL reacción, hay cerca de 1010 moléculas. Cada muestra de PCR se debe evaluar para el número de las copias de la blanco que contiene o que puede contener. Por ejemplo, 1 ng de DNA de la lambda contiene 1.8 × 107 copias. Para el número PCR de la copia de la bajo-entrada de informacio'n, la enzima llega a ser limitadora y puede ser necesario dar al proceso de la extensión incremental más tiempo. Los cyclers termales pueden realizar confiablemente este procedimiento automático de la extensión del segmento para maximizar la producción de PCR.

Condiciones Del Comienzo Caliente

Todas las optimizaciones antedichas también se aplican a un PCR que se diseñe, del principio, con un método del comienzo caliente. A menudo, un comienzo caliente se puede incorporar con éxito en un PCR previamente optimizado sin cambiar las condiciones de la reacción. Sin embargo, paga generalmente reoptimize después de agregar un comienzo caliente. La optimización es a menudo un equilibrio entre producir tanto producto como sea posible y overproducing no específico, amplificaciones del fondo. Porque el comienzo caliente reduce grandemente amplificaciones del fondo, los alojamientos superiores se levantan en condiciones tales como concentración de la enzima, completan un ciclo número, y la concentración del cofactor del ion del metal. PCRs sensible que se ha templado altamente sin un comienzo caliente puede fallar cuando se agrega un comienzo caliente. Esto se puede causar por leve retrasa en los ciclos tempranos causados por mezclarse o la activación de la enzima. El PCR se puede restablecer generalmente, a menudo con aumento substancial en producto específico, simplemente aumentando limitando parámetros o los reactivo. Además, hay optimizaciones específicas a cada método del comienzo caliente. El mezclarse o la activación de la enzima se puede afectar por el volumen de PCR, la composición y pH, cosolvents, condiciones que completan un ciclo del almacenador intermediario, etcétera. La literatura específica’del producto s, a menudo un separador de millares del producto, se debe consultar para la información sobre estas consideraciones.