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Comience primero con un plasmid que contiene un gene con un codon del tyrosine del TAC que deseemos alterar a un codon del phenylalanine de TTC. Para lograr esto que necesitamos cambiar EN el par (azul) en la original a un par de TA. Este plasmid fue aislado de una tensión normal de E.coli que desnaturaliza en fecha secuencias de GATC. Indican a los grupos metílicos en amarillo. Los pasos de progresión siguientes se realizan para lograr esto:

• Caliente el plasmid para separar sus hilos.
• Entonces destemplamos las cartillas mutágenas que contienen el codon de TTC, o su complemento reverso, GAA. La base alterada en cada cartilla se indica en color de rosa.
• Entonces realizamos algunos redondos de PCR (cerca de 8) con las cartillas mutágenas para amplificar el plasmid con el codon alterado. Utilizamos una polimerasa estable de la DNA del calor, tal como polimerasa de Pfu, para reducir al mínimo errores en el copiado del plasmid.
• Entonces tratamos la DNA en la reacción de PCR con DpnI para digerir el salvaje-tipo desnaturalizado DNA. Puesto que el producto de PCR fue hecho in vitro, no se desnaturaliza y no se corta. Transformamos pasado las células del E. coli con la DNA tratada. En principio, solamente la DNA transformada sobrevive para transformar. Esto es controlada ordenando la DNA del plasmid de varios se reproduce.



Factores para un PCR acertado

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