Polimerasas de la polimerización en cadena

Eligiendo la polimerasa de DNA derecha es determinado por las punterías del experimento. Hay una cantidad extensa de anzymes disponibles en el comercio a elegir de ese diferencia en su processivity, estabilidad termal y fidelidad. La enzima más común usada es polimerasa de DNA de Taq también conocida tan comercialmente como, polimerasa de DNA de AmpliTaq®.

Polimerasa de DNA de AmpliTaq

La polimerasa de DNA de AmpliTaq es una enzima recombinante altamente caracterizada para la polimerización en cadena. Producido en Escherichia Coli del gene de la polimerasa de DNA de Taq, así asegurando gran pureza. Se suministra y se utiliza comúnmente como solución de 5 U/μL en el 50% protegido (v/v) glicerol.

Properities físico: La enzima es una proteína del kDa 94 con una actividad de la polimerización 5 ' - 3 ' que sea la más eficiente del rango 70°-80°C. Es increíblemente termoestable, con un período en 95°C de 35-40 Min. en términos de ciclo termal, el período es aproximadamente 100 ciclos. Los productos de la polimerización en cadena usando esta enzima tendrán solas proyecciones bajas en los 3 ' extremos de cada hilo polimerizado (esto se puede explotar para el uso con vectores de la reproducción de T/A).

Bio reacciones: La polimerasa de DNA requiere el ion del magnesio como cofactor y cataliza la reacción de la extensión de un modelo preparado en 72°C. Los cuatro dNTPs se utilizan para ampliar la cartilla y therby para copiar la secuencia de la blanco. Los nucleótidos también modificados se pueden incorporar en productos de la polimerización en cadena.

Actividades: Esta enzima tiene a fork-como el dependiente de la estructura, polimerización realzada, actividad de la nucleasa 5 ' - 3 '. La actividad que posee la permite que el ti degrada las cartillas rio abajo e indicó que las blancos del circuka se deben linearizar antes de la amplificación. También esta actividad de la nucleasa se ha empleado en una técnica de señal-generación fluorescente para la cuantificación de la polimerización en cadena. Esta enzima no tiene actividades inherente del exonuclease 3 ' - 5 ' o el corregir, pero produce amplicons de la alta producción para la mayoría de las aplicaciones.

Polimerasa del oro de AmpliTaq

Esta enzima es una polimerasa de DNA químicamente modificada de AmpliTaq, la modificación reversible mantiene la enzima inactiva en la temperatura ambiente. El pH de alta temperatura y bajo promueve la revocación, restableciendo la actividad enzimática. Estas condiciones ocurren en una polimerización en cadena Tris-protegida en 92°-95°C (el Tris-Cl formuló a pH 8.3 en las gotas 25°C debajo de pH 7.0 sobre 90°C). El oro de AmpliTaq se formula para realizar iguales que la polimerasa de DNA de 5 U/μL AmpliTaq. Por lo tanto, un comienzo caliente se puede agregar a la mayoría del PCRs optimizado con la polimerasa de DNA de AmpliTaq substituyendo el oro de AmpliTaq y agregando 10 un minuto, 95°C, pre-POLIMERIZACIÓN EN CADENA, paso de progresión de la activación.

Los mismos resultados se pueden alcanzar sin el paso de progresión de la activación pre-POLIMERIZACIÓN EN CADENA agregando 10 adicionales o más ciclos de la polimerización en cadena. Bajo estas condiciones, la enzima se activa incremental durante los pasos de progresión de la desnaturalización de la polimerización en cadena.

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