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Reacción en Cadena De la Polimerasa - PCR
Índice:
Introducción a PCR - reacción en cadena de la polimerasa
Reacción en Cadena De la Polimerasa (PCR)
PCR, un concepto que se descubrirá
Especificidad y eficacia de Polymerases/Reaction
Misincorporation: Errores de sistemas ines vitro
¿PCR será substituido siempre? – Amplificación Helicase-dependiente (HDA)
Hace más de 30 años, la introducción de la tecnología de DNA recombinant como una herramienta para las ciencias biológicas revolucionó el estudio de la vida. La reproducción molecular permitió el estudio de los genes individuales de organismos vivos; sin embargo esta técnica era dependiente en la obtención de una cantidad relativamente grande de DNA pura. Esto dependió de la réplica de la DNA de plasmids o de otros vectores durante la división de célula de microorganismos (1). Los investigadores lo encontraron extremadamente laborioso y difícil de obtener una DNA específica en cantidad de la masa de los genes presentes en una muestra biológica (2). La tecnología de DNA recombinant hizo posible el primer análisis molecular y la diagnosis prenatal de varias enfermedades humanas. La DNA fetal obtenida por el muestreo del amniocentesis se podía analizar por la digestión de la enzima de la restricción, el electrophoresis, la transferencia meridional y el hibridación a un gene reproducido o a las puntas de prueba del oligonucleotide (3). Sin embargo, el borrar meridional permitió solamente asociar rudimentario de genes en individuos sin relación (4).
PCR, siglas para la reacción en cadena de la
polimerasa (5.6), permitió la producción de cantidades grandes de
una DNA específica de un modelo complejo de la DNA en una reacción
enzimática simple. PCR es un procedimiento
recientemente desarrollado para la amplificación in vitro de la DNA. PCR ha
transformado la manera que casi todo estudia requerir la manipulación
de los fragmentos de la DNA se puede realizar como los resultados de
su simplicidad y utilidad (7).
En los años 80, Kary Mullis (el cuadro 1) y un equipo de
investigadores en Cetus Corporation en Cetus Corporation concibieron
de una manera de comenzar y de parar la acción de una polimerasa en
las puntas específicas a lo largo de un solo hilo de la DNA. Mullis también realizó que enjaezando este componente
de la tecnología molecular de la reproducción, la DNA de la blanco
podría exponencial ser amplificada. Este procedimiento
de la amplificación de la DNA fue basado en un proceso in vitro más
bien que in vivo (5.6.8). La amplificación sin células
de la DNA de PCR podía simplificar muchos de los procedimientos
estándares para la reproducción, analizando, y de los ácidos
nucleic de modificación (1). Las técnicas anteriores
para aislar un pedazo específico de DNA confiaron en el gene que
reproducía – un procedimiento aburrido y lento. PCR, por otra parte kerry Mullis indicado “le deja escoger el pedazo de DNA usted’re
interesado adentro y tener tanto de él mientras que usted desea” (2.8). Cuando otros científicos de Cetus
tenidos éxito eventual en la fabricación de la reacción en cadena
de la polimerasa se realizan según lo deseado en una manera
confiable, tenían una técnica inmenso de gran alcance para
proporcionar esencialmente a cantidades ilimitadas de los biólogos
moleculares materiales genéticos exactos y de otros requeridos para su trabajo
(8). Desde el primer informe in1985, más de 5000
papeles científicos fueron publicados antes de 1992 (1). Además, the.large.number.of publicaciones por supuesto
hacen imposible repasar todas las contribuciones importantes al
desarrollo y a la aplicación de la tecnología de PCR; sin
embargo procuraremos repasar aquí los progresos más importantes de
la práctica de PCR básico.
PCR fue pensado para ser concebido por el Dr.
Kerry Mullis en 1983 mientras que trabajaba en el Cetus Corporation en
Emeryville, CA. Sin embargo, un cierto trabajo pionero
también fue hecho por Gobind Khorana en 1971 quién describió un
principio de base de replegar un pedazo de DNA usando dos cartillas. El progreso entonces fue limitado por ediciones
superelegantes de la purificación de la síntesis y de la polimerasa
(9). En la pista’de Mullis s, la
invención creció de un esquema teórico para realizar ordenar
limitado del dideoxynucleotide de genes humanos únicos usando los
oligonucleotides sintetizados con el fin de mutaciones humanas comunes
de la enfermedad que diagnosticaban. Un obstáculo obvio
a una estrategia que ordenaba tan directa era la alta complejidad de
los pares bajos humanos del genoma (3.3 x 109). Así, un segundo oligonucleotide o cartilla fue agregado
para bloquear la progresión de la síntesis de la primera cartilla. Más adelante sin embargo, esta segunda cartilla fue
incluida para atar al otro hilo de la DNA, de modo que cada hilo del
allele del mutante contribuyera a la señal eventual. Si
el esquema que implicaba el hibridación simultáneo de cartillas a
cada hilo fuera modificado calentando la mezcla y después relanzando
el recocido y los pasos de progresión de la extensión, entonces la
señal primaria sería incluso más futura creciente. Relanzar los pasos de progresión permitiría a los
productos del primer redondo ser duplicada en el segundo ciclo, para
rendir dos copias. Relanzar el ciclo daría lugar otra
vez a cuatro copias, et a cetera. Varias semanas pasaron antes de que esta
gran idea fuera procurada (8). Dos cartillas fueron
sintetizadas para ser perfectamente complementarias a cada final de la
región baja del par 110 de un segmento reproducido del gene humano
del b-globin, la amplificación fue realizada, y los productos fueron
identificados por electrophoresis del gel de la acrilamida. El resultado final era el fragmento bajo anticipado de
la DNA del par 110 y el principio de PCR como técnica básica en la
biología molecular (5.6).
En PCR original de Mullis process(5,6,8), la enzima fue
utilizada in vitro (en un
ambiente controlado fuera de un organismo). La DNA
double-stranded fue separada en dos solos hilos calentándola a 96°C. En esta temperatura, sin embargo, la
polimerasa de la DNA de E.Coli fue
destruida de modo que la enzima tuviera que ser llenada después de la
etapa de la calefacción de cada ciclo. El proceso
original de PCR de Mullis era muy ineficaz puesto que requirió época
mucha, cantidades extensas de DNA-Polimerasa, y la atención continua
a través del proceso de PCR.
La examinación del mecanismo de la
amplificación de PCR revela su simplicidad pero también su elegancia
(cuadro 2). Las cartillas del oligonucleotide primero se
diseñan para ser complementarias a los finales de la secuencia que se
amplificará, y después mezclada en exceso molar con el modelo de la
DNA y deoxyribonucleotides en un almacenador intermediario apropiado. Calefacción de siguiente para desnaturalizar los hilos
de la original y refrescarse para promover el recocido superelegante,
los oligonucleotides cada lazo a un diverso hilo del fragmento de la
blanco. Se colocan las cartillas de modo que cuando cada
uno es ampliada por la acción de una polimerasa de la DNA, los hilos
nuevamente sintetizados solapen el sitio obligatorio del
oligonucleotide opuesto. A medida que el proceso de la
desnaturalización, del recocido, y de la extensión de la polimerasa
se continúa las cartillas atan en varias ocasiones al modelo original
de la DNA y a los sitios complementarios en los hilos nuevamente
sintetizados y se extienden para producir nuevas copias de la DNA
(cuadro 3). El resultado final es un aumento exponencial
en el número total de los fragmentos de la DNA que incluyen las
secuencias entre las cartillas de PCR, que finalmente se representan
en una abundancia teórica de 2n, donde está el número n de los
ciclos (1.7.13).
Una polimerasa de la DNA es una enzima naturalmente que ocurre, una
macromolécula biológica que catalice la formación y la reparación
de la DNA. Trabaja atando a un solo hilo de la DNA y creando un
hilo complementario. La réplica exacta de toda la
materia viva depende de esta actividad, donde funciona para duplicar
la DNA cuando las células se dividen (10.11). Solamente
recientemente tenga científicos aprendidos para manipular esta
actividad y para aplicarla a la investigación científica. Los experimentos más tempranos de PCR utlilized el
fragmento de Klenow de la polimerasa I de la DNA de coli de
escherichia en una temperatura de 37C para amplificar blancos
específicas de la DNA genomic humana (5.6). Estas
reacciones de PCR produjeron a menudo el producto incompleto puro de
la blanco según lo juzgado por el electrophoresis del gel (1). Estas amplificaciones iniciales de PCR con el fragmento
de Klenow no eran altamente específicas (5.6). Aunque
un fragmento único de la DNA podría ser el doblez amplificado
~200,000 de la DNA genomic, sólo el cerca de 1% del producto de PCR
eran la secuencia apuntada (13). Una punta de prueba
específica del hibridación fue requerida analizar la DNA amplificada
(5.6).
Las condiciones de algún PCR fueron determinadas para aumentar
el rigor del hibridación superelegante tal como concentraciones más
bajas del mgCl2 y temperaturas más altas del recocido.
Además, la concentración de la enzima y de cartillas, la
época de recocido, el tiempo de la extensión, y el número de PCR
completa un ciclo toda fueron encontrados para efectuar la
especificidad del PCR.
También, la concentración de una secuencia específica en una
muestra puede también influenciar la homogeneidad relativa de los
productos de PCR (1.7.13.14.15). Los trifosfatos y el
magnesio de Deoxyribonucleotide en un almacenador intermediario
apropiado son también ingredientes importantes para PCR. La eficacia y la especificidad de PCRs se pueden afectar
por variaciones en la concentración y la relación de transformación
del magnesio, de los trifosfatos del deoxyribonucleotide, y de las
cartillas libres. Estos reactivo se deben optimizar para
alcanzar la altas especificidad y producción (14). También fue descubierto que el efecto de la temperatura
y de la longitud de la cartilla del oligonucleotide en la
especificidad y la eficacia de la amplificación por la reacción en
cadena de la polimerasa (15).
La inactivación del fragmento de Klenow de la polimerasa
I de la DNA de coli de escherichia en la temperatura alta requerida
para la separación del hilo requirió la adición de la enzima
después del paso de progresión de la desnaturalización de cada
ciclo (5.6). Antes de 1988, cualquier persona que
conducía un procedimiento de la reacción de PCR fue obligada para
sentarse pacientemente por una serie de baños del agua o de bloques
de calefacción y para agregar una parte alícuota fresca de la polimerasa de la DNA de
E.Coli después de cada paso de progresión de la
desnaturalización, que fue realizado típicamente sumergiendo el
recipiente de la reacción en el agua hirvienda para ½ un
minuto a 3 minutos (7). Este paso de progresión algo
aburrido fue eliminado por la introducción de una polimerasa
termoestable de la DNA, la polimerasa de la DNA de Taq (12) una vez, al principio de
la reacción de PCR. Las características termoestables
de la actividad de la polimerasa de la DNA fueron aisladas del
aquaticus de Thermus (Taq) (el cuadro 4) que crecen en géiseres de
110C excesivo, y ha contribuido grandemente a la producción, a la
especificidad, a la automatización, y al utilitario de la reacción
en cadena de la polimerasa (1.7.12). La
enzima de Taq puede soportar la calefacción
relanzada a 94C y cada vez que la mezcla se refresca para permitir que
las cartillas del oligonucleotide aten el catalizador para la
extensión está tan ya presente (1.7). Sin embargo,
temperaturas más altas del recocido no fueron establecidas hasta el
solo “desarrollo más importante del desarrollo de PCR” (8), de la purificación y de la distribución comercial
de una polimerasa a prueba de calor de la DNA del aquaticus
thermophilic de Thermus de la
bacteria (Taq) (12).
El aislamiento de una polimerasa a prueba de calor de la DNA
también permitió el recocido superelegante y la extensión que se
realizará en las temperaturas elevadas (1.7.12.13), de tal modo
reduciendo unió mal el recocido a las secuencias del nontarget
(amplificación no específica) o a la especificidad de aumento. De esta manera, porque de muchas amplificaciones el
producto de PCR se podría detectar como venda bromuro-manchada solo
ethidium en un gel electrophoretic (12). Esta
especificidad creciente también aumentó la producción de la DNA de
la secuencia de la blanco. Por otra parte, productos
más largos de PCR se podían amplificar de la DNA genomic,
probablemente debido a una reducción en la estructura secundaria de
los hilos del modelo en la temperatura elevada usada para la
extensión superelegante. El límite superior de la
talla para la amplificación de la polimerasa del fragmento de Klenow
estaba solamente sobre 400bp. La polimerasa de Taq y
otras polimerasas termoestables han sintetizado fragmentos hasta 10 KB
(1.7.12.13). La disponibilidad de la
polimerasa de Taq también ha simplificado
grandemente la automatización de la reacción pues es una tarea mucho
más fácil construir un aparato que complete un ciclo un tubo de la
reacción con diversas temperaturas que fabricar un dispositivo que
realizaría thermocycling y la adición de las partes alícuotas de la
enzima. Hay actualmente una gran variedad de
thermocyclers disponibles comercialmente. Este
desarrollo ha sido un factor significativo en la aplicación rápida
de esta tecnología por la comunidad científica (7).
Además de la producción de los fragmentos
double-stranded, embotado-terminados de la DNA que se pueden formar
por PCR, dos otras características del PCR proyectan contribuyen
grandemente al utilitario de PCR. Primero, la posición
del atascamiento de las cartillas define los límites del fragmento
amplificado y por lo tanto el requisito molecular anterior de la
reproducción de los sitios del reconocimiento del endonuclease de la
restricción no se requiere para PCR. Pues solamente un
número limitado de las secuencias de la DNA es sitios de la
restricción, PCR aumenta grandemente la flexibilidad de la opción de
la talla y de la composición del fragmento. En segundo
lugar, no es necesario que los oligonucleotides de PCR sean
exactamente complementario a la DNA del modelo. “Las
colas” se pueden agregar al extremo’ 5 de la
cartilla para introducir secuencias dentro de los sitios del
oscurecimiento que se pueden explotar así para introducir sitios del
reconocimiento del endonuclease de la restricción u otras secuencias
útiles tales como mutaciones en la DNA amplificada. Este los fenómenos permitieron la aparición de PCR
como método para la reproducción rápida de la DNA (1.7.13).
La reproducción molecular ha beneficiado de la
aparición de PCR como técnica. La reproducción
directa primero fue conducida usando un fragmento de la DNA de 110
puntos de ebullición amplificado por PCR y las cartillas del
oligonucleotide que contuvieron sitios del reconocimiento del
endonuclease de la restricción agregaron a sus 5’ extremos. Estos sitios fueron utilizados
para facilitar la reproducción de la DNA amplificada en un plasmid
M13 (17). El fragmento de 110 puntos de ebullición
también fue ordenado para confirmar que este acercamiento era un
acercamiento rápido con todo confiable a la reproducción. (cuadro 5)
La reproducción cell-based de la DNA implica la
réplica de la DNA in vivo, que se asocia a una fidelidad muy alta del copiado debido a
corregir mecanismos. Sin embargo, cuando la DNA se
repliega in vitro como con
PCR, la tarifa de error de copiado es considerablemente mayor. La polimerasa lo más extensamente posible usada, polimerasa de la DNA de
Taq sin embargo, no tiene ningún exonuclease asociado’3 a’ 5 a consultar una función que
corrige. Así la tarifa de error debido al
misincorporation bajo durante la réplica de la DNA es algo alta para Taq: para un 1 KB ordene
que ha experimentado 20 ciclos eficaces de duplicación, el
aproximadamente 40% de los hilos nuevos de la DNA sintetizado por PCR
que usa esta enzima contendrá un nucleotide incorrecto resultando de
un error de copiado (16). Por lo tanto, iguale si la
reacción de PCR implica la amplificación de una sola secuencia de la
DNA, el producto final será una mezcla casi de corresponder con, pero
secuencias no idénticas de la DNA. A pesar de los
errores debido a la réplica in vitro, el ordenar de la DNA del producto total de PCR puede dar
la secuencia correcta debido al hecho de que la incorporación de
bases incorrectas es esencialmente al azar y la contribución de una
base incorrecta en unos o más hilos es abrumada por las
contribuciones de la mayoría enorme de los hilos que tendrán la
secuencia correcta. Sin embargo, si se va el producto de
PCR a ser reproducido en células, vario el individuo se reproduce
puede necesitar ser ordenado para determinar la secuencia correcta
(del consenso), antes de experimentos posteriores que conducen.
Más recientemente, el problema de la infidelidad de la réplica
de la DNA durante la reacción de PCR ha sido reducido
considerablemente usando las polimerasas termoestables alternativas de
la DNA que han asociado actividad’ del exonuclease 3’ a 5. Las polimerasas y ThermococcusLitoralis(RESPIRADERO) de la DNA del furiosus
de Pyrococcus (Pfu) se están
convirtiendo utilizaron más extensamente debido a corregir consultado
por la actividad de su exonuclease’ asociado 3’ a 5 (18). El producto de PCR que resulta
de Pfu por ejemplo, tiene un mucho nivel inferior de las mutaciones
introducidas copiando errores: para un segmento de 1 KB de la
DNA que ha experimentado 20 ciclos eficaces de duplicación, cerca de
3.5% de la DNA trenza en el producto llevan una base alterada (16).
Los nuevos acercamientos para mejorar
especificidad se han desarrollado basaron en el reconocimiento que la
polimerasa de la DNA de Taq conserva actividad enzimática
considerable en las temperaturas bien debajo del grado óptimo para la
síntesis de la DNA. Así, las cartillas que destemplan
non-specifically a una región trenzada parcialmente sola del modelo
pueden ser extendidas antes de que la reacción alcance 72°C para la
extensión de cartillas específicamente destempladas. Si se activa la polimerasa de la DNA solamente después
que la reacción ha alcanzado altas (> 70°C) temperaturas, la
amplificación de la no-blanco puede ser reducida al mínimo (19.20). Este “acercamiento del comienzo” caliente se puede lograr por la adición manual de un
reactivo esencial al tubo de la selección en las temperaturas
elevadas. La adición de la proteína obligatoria del
ssDNA también ha estado señalada para aumentar la amplificación
específica. Un acercamiento más convivial es utilizar
la inhibición o la inactivación de la polimerasa de la DNA sí
mismo. Dos tipos de inhibición de la polimerasa de la
DNA de Taq se han intentado incluyendo la inhibición del
oligonucleotide (21) y la inhibición del anticuerpo (22). Los
inhibidores altamente específicos del oligonucleotide de ambas
polimerasas de la DNA de Taq se han producido. Éstos
inhiben selectivamente actividad de la polimerasa de la DNA en las
temperaturas debajo de 40°C y se han mostrado a la función en
aplicaciones del comienzo caliente. Alternativomente,
uno puede utilizar un anticuerpo contra la polimerasa de la DNA de
Taq. El anticuerpo inhibe la polimerasa de la DNA hasta que la
temperatura del PCR es tal que el anticuerpo está desnaturalizado en
una temperatura mayor que 55°C, de tal modo release/versión la
enzima. Al menos hay desventajas a este tipo de
condiciones del comienzo caliente. En este caso, uno
necesita un anticuerpo para cada diversa enzima usada en un PCR y para
una gran cantidad de PCRs éste puede levantarse los costes
perceptiblemente. La forma más conveniente de comienzo
caliente es modificar la polimerasa de la DNA de una manera tal que
sea inactiva en la temperatura ambiente (mutante
temperatura-sensible), y se reactiva solamente después de la
incubación en 95°C por 6-15 minutos (23).
Debido a su simplicidad, PCR es una técnica
popular con una amplia gama de aplicaciones
incluyendo ordenar directo, la reproducción genomic,
la DNA que pulsa, la detección de microorganismos infecciosos, la
mutagénesis sitio-dirigida, la investigación genética prenatal de
la enfermedad, y el análisis de las variaciones allelic de la
secuencia (1.7.13.16) que dependen de esencialmente tres ventajas
importantes del método:
Velocidad y facilidad de empleo: La
reproducción de la DNA de PCR se puede realizar en una cantidad de
tiempo relativamente corta, dentro de algunas horas. Generalmente, una reacción de PCR consiste en alrededor
30 ciclos cada ciclo que contiene una desnaturalización, síntesis y
reannealing el paso de progresión, con un ciclo individual tomando
típicamente 3
5 minutos en un cycler termal
automatizado. Esto es claramente más rápido que el
tiempo requerido para la reproducción cell-based de la DNA, que
podría tomar semanas del tiempo. Además, es
absolutamente fácil setup una reacción de PCR y el uso de una
máquina del thermocycler es también fácil. Una cierta
hora se requiere para el diseño y la síntesis de las cartillas del
oligonucleotide, pero esto ha sido simplificada por la disponibilidad
del software para el diseño superelegante y la síntesis comercial o
académica rápida de oligonucleotides de encargo. La
optimización de las condiciones de PCR se puede requerir por ejemplo
temperatura superelegante del recocido, la concentración del
magnesio, y la concentración superelegante. Sin
embargo, la creación de las máquinas del gradiente PCR que permiten
que una variedad de temperaturas superelegantes del recocido sea
probada en el mismo tiempo ha disminuido grandemente el tiempo
requerido para este paso de progresión. Las condiciones
óptimas para una reacción se han obtenido una vez, la reacción
pueden entonces ser relanzadas simplemente (1.7.13.16).
Sensibilidad: PCR es capaz de
amplificar las secuencias de cantidades minuciosas de DNA de la
blanco, incluso la DNA de una célula (24). Tal
sensibilidad exquisita ha producido nuevos métodos de estudiar la
patogenesia molecular y ha encontrado aplicaciones numerosas en
ciencia forense, en diagnosis, en análisis genético del acoplamiento
usando la solo-esperma que pulsaba y en los estudios moleculares de la
paleontología, donde las muestras pueden contener números minuciosos
de células. Sin embargo, la sensibilidad extrema del método
significa que el gran cuidado tiene que ser tomado para evitar la
contaminación de la muestra bajo investigación por la DNA externa,
por ejemplo de cantidades minuciosas de células del operador
(1.7.13.16).
Robustez: Un amplio rango de las
fuentes del ácido nucleic es modelos convenientes para la
amplificación de PCR. DNAs purificado de la varia
especie y las fuentes se han amplificado. PCR puede
permitir la amplificación de secuencias específicas del material en
el cual la DNA se degrada o se embute gravemente en un media de el
cual el aislamiento convencional de la DNA sea problemático.
Consecuentemente, es otra vez muy conveniente para la
antropología molecular y la paleontología estudia, por ejemplo el
análisis de la DNA recuperado del restos arqueológico.
También se ha utilizado con éxito para amplificar la DNA de
formalina-fijo o las muestras parafina-embutidas del tejido fino, que
tiene aplicaciones importantes en patología molecular y, en algunos
casos, acoplamiento genético estudian. Generalmente, el
éxito de la amplificación de PCR es el más grande cuando los
fragmentos de la blanco son relativamente abundantes (1.7.13.16).
A pesar de su renombre enorme, PCR tiene ciertas
limitaciones como método para selectivamente reproducir secuencias
específicas de la DNA.
Para construir las cartillas específicas del oligonucleotide
que permiten la amplificación selectiva de una secuencia determinada
de la DNA, una cierta información anterior de la secuencia es
generalmente necesaria. Esto significa normalmente que
la región de la DNA del interés se ha caracterizado en parte
previamente, reproducción cell-based anterior a menudo siguiente de
la DNA. Sin embargo, una variedad de acercamientos se ha
desarrollado que reducen o aún excluyen la necesidad de la
información anterior de la secuencia de la DNA referente a la DNA de
la blanco. Las secuencias previamente uncharacterized de
la DNA se pueden reproducir a veces usando PCR con los
oligonucleotides degenerados si son miembros de un gene o la familia
repetidora por lo menos una de la DNA que de miembros se ha
caracterizado previamente. En algunos casos, PCR se
puede utilizar con eficacia sin ninguna información anterior de la
secuencia referente a la DNA de la blanco para permitir el
indiscriminateamplification de las secuencias de la DNA de una fuente
de la DNA que está presente en cantidades extemely limitadas. Por lo tanto, aunque PCR se puede aplicar para asegurar
la amplificación entera del genoma, no tiene la ventaja de la
reproducción cell-based de la DNA en el ofrecimiento de una manera de
separar la DNA individual reproduce abarcar una biblioteca genomic de
la DNA.
La cantidad de producto de PCR obtenida en una sola reacción es
también mucho limitada que la cantidad que se puede obtener usando la
reproducción cell-based donde escale -para arriba de los volúmenes
de culturas de célula es posible. La eficacia de una reacción
de PCR variará de modelo al modelo y según los varios factores que
se requieren para optimizar la reacción pero típicamente solamente
las cantidades comparativamente pequeñas de producto se alcanzan.
Aunque la producción teórica de PCR es exponencial, la
producción real de un PCR está indicando mucho menos que el esquema
está funcionando con menos que su potencial máximo. Por ejemplo, la cantidad de producto en cada ciclo
nivela eventual apagado. Esta meseta se puede explicar
por los fenómenos siguientes. Primero, algo del modelo
puede nunca ser disponible debido a las roturas del hilo o al
incidente de la DNA a disociado de otras macromoléculas durante la
purificación y los thermocycles iniciales. En segundo
lugar, la cantidad de enzima es finita y la actividad puede disminuir
eventual. En tercer lugar, como la concentración del
producto double-stranded alcanza altos niveles, la competición
aumenta entre el recocido del modelo (producto de PCR) a la cartilla y
de reannealing de los hilos complementarios del modelo (1.7.13).
Desventaja obvia y de muchas veces una gran de PCR como método
de la reproducción de la DNA ha sido el rango de la talla de las
secuencias de la DNA que pueden ser reproducidas. Desemejante de la reproducción cell-based de la DNA
donde la talla de las secuencias reproducidas de la DNA puede acercar
a Mb 2, señalada las secuencias de la DNA reproducidas por PCR han
estado típicamente en los 0.1
5 KB de rango de la
talla, a menudo en el extremo inferior de esta escala. Los fragmentos pequeños de la DNA se pueden amplificar
generalmente fácilmente por PCR, no obstante llega a ser cada vez
más más difícil obtener la amplificación eficiente mientras que la
longitud deseada del producto aumenta. Barnes (25)
reconoció una limitación de la longitud de la blanco a la
amplificación de PCR de la DNA. Él utilizó una
combinación de un alto nivel de un exonuclease-libre, mutante de la
cancelacíon de la N-terminal de la polimerasa de la DNA de Taq,
Klentaq1, con un nivel muy bajo de una polimerasa termoestable de la
DNA que exhibía una actividad 3'-exonuclease (Pfu, respiradero, o
respiradero profundo) para conducir la alta fidelidad de largo PCR.
Por lo menos 35 KB de la lambda del bacteriófago se pueden
amplificar a las altas producciones a partir de 1 ng del modelo de la
DNA de la lambda. El uso de este método rindió
fidelidad creciente del base-par, la capacidad de utilizar productos
de PCR como cartillas, y la producción máxima del fragmento de la
blanco. Otras condiciones se han identificado para la
amplificación eficaz de blancos más largas, incluyendo la
amplificación de hasta 22 KB del racimo beta-globin del gene de la
DNA genomic humana y de hasta 42 KB de la DNA de la lambda del phaga
(26). Las condiciones para estos PCRs largos incluyeron
pH creciente, adición del glicerol y del sulfoxide dimethyl,
disminuida los tiempos de la desnaturalización, creciente los tiempos
de la extensión, y el uso de una polimerasa termoestable secundaria
de la DNA que posee un 3'-to 5'-exonuclease, o de "corregir,"
actividad. El protocolo de "PCR largo" mantuvo la
especificidad requerida para las blancos en la DNA genomic usando
niveles más bajos de la polimerasa y las condiciones de la
temperatura y de la sal para el recocido específico de la cartilla. La capacidad de amplificar secuencias de la DNA de 10-40
KB traerá la velocidad y la simplicidad de PCR a asociar genomic y a
ordenar y facilitará estudios en las genéticas moleculares (26). Generalmente, las condiciones para el rango largo PCR
implican una combinación de modificaciones a las condiciones
estándares con un sistema de la dos-polimerasa. Esto
proporciona a niveles óptimos de la actividad de la polimerasa y del
exonuclease’3 a’ 5 de la DNA que sirve como
mecanismo que corrige (16).
Thermocyclers que regulan automáticamente las
temperaturas para completar un ciclo de PCR fue introducido en 1986
(el cuadro 6). Además de los avances en reactivo de
PCR, los instrumentos nuevos para la termal automatizada que
completaba un ciclo y para analizar productos de PCR se han
desarrollado. Los cyclers termales nuevos han aumentado
índices de la calefacción, refrescándose, y traspaso térmico a los
recipientes modificados de la reacción. Los recipientes
de la reacción acomodados por los cyclers termales de la primera
generación (o aún los baños del agua y los bloques de la
calefacción) eran tubos plásticos estándares del microfuge. La amplificación de PCR en tubos capilares finos
permitió completar un ciclo termal rápido, y síntesis de la DNA a
20s. La velocidad de los cambios de temperatura
alcanzados en estos sistemas ha permitido la definición exacta de los
grados óptimos de la temperatura para cada paso de progresión
individual en el ciclo de PCR. Los cyclers termales de
la nueva generación también acomodan más muestras, tienen perfiles
termales más exactos, y son programables (13).
Una de las menos contribuciones apreciadas a la
aplicación extensa de PCR ha sido el desarrollo de la química
automatizada confiable para la síntesis del oligonucleotide. Hasta hace poco tiempo, la construcción de un solo
oligonucleotide era una tarea substancial que se podría realizar
solamente por un químico orgánico experto. Es posible
ahora comprar cualquier un sintetizador del oligonucleotide que se
pueda funcionar por un técnico o los oligonucleotides ellos mismos
desde una fuente comercial o académica. Las máquinas
múltiplexes de la síntesis del oligonucleotide se han construido con
la puntería de reducir el coste total de la síntesis (27.28). Pues los oligonucleotides definen los productos eventual
de PCR, no hay duda de que en ausencia de su fuente lista, PCR no
habría gozado de la aceptación amplia que ha ganado hoy (13).
Los investigadores convenidos temprano en ése el
diseño de las cartillas de PCR eran difíciles y no fiables. Los programas de computadora fueron ideados para tomar
todos los criterios del diseño en cuenta. Uno de los
primeros programas escritos para el diseño superelegante era Olga que
hizo uso la puesta en práctica de la GEMA de la investigación de
Digital (encargado del ambiente de los gráficos) en el ST de Atari
(29). Olga fue satisfecho específicamente a la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permitía el análisis
simultáneo de dos secuencias superelegantes. La ventaja
de Olga era que proporcionó en los análisis de un programa para las
repeticiones directas, las estructuras secundarias y la dimerización
superelegante tan bien como varias herramientas útiles del '
acabamiento ' para los trabajadores contratados a síntesis de la
optimización y del oligonucleotide de PCR. El programa
Primer3 en el instituto de Whitehead ahora se piensa para ser la
herramienta más confiable y más versátil actualmente disponible
(30).
PCRs se puede ahora realizar permitiendo la
amplificación de los fragmentos de la DNA hasta varios kilobases en
longitud por más de un millón veces su abundancia inicial. El procedimiento es altamente automatable y requiere
apenas algunas horas de comenzar thermocyling al análisis de
producto. Éste no era el caso previamente, y los
requisitos prácticos para realizar un PCR se han simplificado
grandemente desde los primeros manuscritos del método (13). Hoy, la mayoría de los tirones iniciales o las
ineficacias del PCR se han resuelto (8). Además, PCR se
ha ampliado para incluir más de 270.000 artículos (31).
La reacción en cadena de la polimerasa es el método lo más extensamente posible usado para la amplificación in vitro de la DNA sin embargo que requiere la desnaturalización termal o thermocycling para separar los dos hilos de la DNA. In vivo, la DNA es replegada por las polimerasas de DNA con las varias proteínas accesorias. El helicase de la DNA, las proteínas accesorias de una polimerasa de la DNA actúa para separar la DNA a dos caras dentro de las células. Vincent et al. (32) ha ideado un nuevo método isotérmico in vitro de la amplificación de la DNA mímico el mecanismo in vivo de la réplica. la amplificación Helicase-dependiente (HDA) utiliza un helicase de la DNA para generar los modelos solo-trenzados para el hibridación superelegante. La extensión subsecuente de la cartilla entonces es catalizada por una polimerasa de la DNA. HDA no requiere un thermocycler costoso y PCR se puede realizar así prácticamente dondequiera. Además, ofrece varias ventajas sobre otros métodos isotérmicos de la amplificación de la DNA teniendo un esquema simple de la reacción y siendo una reacción isotérmica verdadera que se puede realizar en una temperatura para el proceso entero. HDA ofrece gran promesa en el desarrollo de los dispositivos de diagnóstico portables simples de la DNA de ser utilizado en el campo y en el punta-de-cuidado (32).
Se dice que la manera más simple y más
conveniente de definir PCR está como técnica. Sin embargo,
tal clasificación elimina la historia del desarrollo de PCR's tantos
individuos sobre los años contribuidos a las ideas detrás de la
teoría de PCR y de fino-templar de la técnica. La
respuesta más simple siguiente es nombrar a un individuo como el
inventor de la reacción en cadena de la polimerasa. Karry Mullis fue concedido el premio Nobel para la
química en 1993 para su descubrimiento de PCR. Sin
embargo, este descubrimiento se disputa entre muchos científicos, que
pudieron haber contribuido a abrir este rompecabezas.
También se ha dicho que no existió PCR hasta que fue hecho
para trabajar en un sistema experimental. Con esto en
mente, el pensamiento de un concepto no es simplemente suficiente;
un concepto se debe haber puesto con éxito en la práctica
(33).
Aunque hay duda en cuanto a el último creador de PCR, y duda en
cuanto a la posibilidad que PCR puede ser substituido de alguna manera
o alguna vez, hay poco duda el impacto que PCR ha creado sobre una
duración corta en el estudio de la biología y de la vida
moleculares.
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