Expresión recombinante de la proteína

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Cuando usted quiere caracterizar un gene o una proteína del interés, usted debe primero estudiar su función. En esta era molecular, la obtención de un cDNA de su gene del interés no es difícil.

Para expresar el cDNA como proteína, IE. una proteína recombinante, una puede entonces realizar fácilmente estudios funcionales usando la proteína purificada recombinante.

Una vez que usted tiene una proteína purificada usted puede conducir:

• experimentos de la interacción de la Proteína-proteína
• Cinética de la enzima
• Estudios funcionales de la proteína
• Estudios estructurales - incluyendo la cristalización de la proteína, la estructura de la proteína y el RMN.
• Usted puede también utilizar la proteína para hacer los anticuerpos para otros experimentos.

Hay dos sistemas principales para la expresión de la proteína recombinante. Una vez que usted consigue su cDNA reproducido, usted debe decidir donde usted quiere amplificar su proteína. Esto será (generalmente un sistema procariótico (bacteriano) o eucariótico de la levadura o de la célula mamífera). La opción de su sistema decidirá en a qué vector usted necesitará reproducir su cDNA pues hay diversos promotores que funcionan en Escherichia Coli y otros que trabajan mejor con levadura o sistemas mamíferos.

¿Tan que el sistema de la expresión de la proteína usted utilizaron?

 Sistemas para la expresión de la proteína

Sistemas procarióticos de la expresión de la proteína

Los sistemas recombinantes procarióticos de la expresión de la proteína tienen varias ventajas. Éstos incluyen la facilidad de la cultura, y el significado muy rápido del crecimiento de la célula que usted no tendrá que esperar de largo para conseguir la proteína de sistemas bacterianos una vez que usted reproduce su cDNA. La expresión se puede inducir fácilmente en sistemas bacterianos de la expresión de la proteína usando IPTG. También, la purificación es absolutamente simple en sistemas procarióticos de la expresión y hay una plétora de kits comerciales disponibles para la expresión recombinante de la proteína.

Por una parte, si usted necesita utilizar sus proteínas para los estudios funcionales o enzimáticos los sistemas procarióticos son un problema como la mayoría de las proteínas llegan a ser insolubles en cuerpos de inclusión y son muy difíciles de recuperarse como proteínas funcionales. Además, la mayoría si no todas las modificaciones poste-de translación no son agregadas por las bacterias y por lo tanto su proteína del interés puede no ser funcional. Los estudios enzimáticos así pueden ser estéril.

Sistemas eucarióticos de la expresión

Los genes eucarióticos no están realmente “en el país” en células procarióticas, incluso cuando se expresan bajo control de los vectores procarióticos.  Una razón es que las células de Escherichia Coli reconocen los productos de la proteína de genes eucarióticos reproducidos como forasteros y los destruyen con frecuencia.  Otro es que los prokaryotes no realizan las mismas clases de modificación del posttranslational que lo hacen los eucariotas.  Por ejemplo, una proteína que sería juntada ordinariamente a los azúcares en una célula eucariótica será expresada como proteína descubierta cuando está reproducida en bacterias.  Esto puede efectuar la actividad o la estabilidad de una proteína, o por lo menos su respuesta a los anticuerpos.  Un más problema grave es que el interior de una célula bacteriana no está como conducente al plegamiento apropiado de proteínas eucarióticas como el interior de una célula eucariótica.  Con frecuencia, el resultado plegable incorrectamente, los productos inactivos de genes reproducidos. 

Los sistemas eucarióticos para la expresión de la proteína incluyen:

• levadura
• células mamíferas
• células del baculovirus (insecto)

Todos estos sistemas son grandes sistemas eucarióticos para la expresión de proteínas recombinantes.
Las ventajas de los sistemas eucarióticos de la expresión de la proteína incluyen el hecho de que usted puede conseguir mismo niveles de la expresión. Las proteínas son fáciles de purificar usando las etiquetas especiales que son incluidas en los vectores incluyendo el suyo, Myc y otras etiquetas.

Usted puede incluso comprar los plásmidos que secretan su proteína en los media. Por lo tanto usted puede guardar el crecer de su sistema y el recoger de los media sin lysing sus células. No hay cuerpos de inclusión a preocuparse alrededor y sus proteínas tienen modificaciones poste-de translación intactas. Éstos son vitales si usted está estudiando la función de las interacciones de una proteína y/o de la proteína-proteína.

Las desventajas de los sistemas eucarióticos de la expresión de la proteína incluyen el hecho de que las células eucarióticas crecen más lentas que las células procarióticas.

Vectores de la expresión con los promotores fuertes

La función principal de un vector de la expresión es rendir el producto de un gene generalmente, más el producto el mejor.  Por lo tanto, los vectores de la expresión se equipan ordinariamente de los promotores muy fuertes; el análisis razonado es que se produce cuanto más mRNA, más el producto de la proteína será hecho.
Un tal promotor fuerte es el promotor del trp (operon del triptófano).  Forma la base para varios vectores de la expresión, incluyendo ptrpL1.  Hace una región del promotor/del operador del trp, seguir por un punto de enlace del ribosoma, y puede ser utilizado directamente como vector de la expresión insertando un gene no nativo en el sitio de ClaI. Alternativamente, la región de control del trp se puede hacer “portable” recortándolo con ClaI e HindIII e insertándolo delante de un gene que se expresará en otro vector

Vectores inducibles de la expresión

Es generalmente ventajoso mantener un gene reproducido represed hasta que estemos listos para expresarlo.  Una razón es que las proteínas eucarióticas producidas en granes cantidades en bacterias pueden ser tóxicas.  Incluso si estas proteínas no son realmente tóxicas, pueden aumentar hasta los grandes niveles de auch que interfieren con crecimiento bacteriano.  En cualquier caso, si el gene reproducido fuera permitido seguir girado constantemente, las bacterias que llevan el gene nunca vendrían bastante una gran concentración para producir cantidades significativas de producto de la proteína.  La solución es mantener el gene reproducido apagado colocándolo rio abajo de un promotor inducible que pueda ser apagado.
El promotor de la laca es inducible hasta cierto punto, probablemente permaneciendo apagado hasta estimulado por el isopropylthiogalactoside sintetizado del inductor (IPTG).  Sin embargo, la represión causada por el represor de la laca es incompleta, y una cierta expresión del gene reproducido será observada incluso en la ausencia de inductor.  Una forma alrededor de este problema es expresar nuestro gene en un plásmido o un phagemid que lleve su propio gene del lacI, como lo hace el pBS.  Exceso del represor producido por tal vector mantiene nuestro gene reproducido apagado hasta que estemos listos para inducirlo con IPTG.
Otra estrategia es utilizar a un promotor rigurosamente controlado como el promotor bacteriófago PL del λ. Los vectores de la expresión con este sistema del promotor/del operador se reproducen en las células huesped que llevan un gene termosensible del represor del λ (c1857).  Mientras mantengamos la temperatura de estas células relativamente baja (32°C), el represor funciona, y ninguna expresión ocurre.  Sin embargo, cuando levantamos la temperatura al nivel nonpermissive (42ºC), el represor termosensible puede funcionar no más y se induce el gene reproducido.

Vectores de la expresión que producen las proteínas de la fusión

Cuando la mayoría de los vectores de la expresión funcionan, producen las proteínas de la fusión.  Esto pudo al principio parecer una desventaja porque el producto natural del gene insertado no se hace.  Sin embargo, los aminoácidos adicionales en la proteína de la fusión pueden ser una gran ayuda en la purificación del producto de la proteína.

Considere los vectores de la expresión de la oligo-histidina, uno cuyo tiene los pTrcHis del nombre comercial.  Éstos tienen una secuencia corta apenas contracorriente desde el sitio múltiple de la reproducción que codifica un estiramiento de seis histidinas.  Así, una proteína expresada en tal vector será una proteína de la fusión con seis histidinas en su extremo amino.  ¿Por qué querríamos asociar seis histidinas a nuestra proteína?  las regiones de la Oligo-histidina como esto tienen una alta afinidad para los metales como el níquel, así que podemos purificar las proteínas que tienen tales regiones usando la cromatografía de afinidad del níquel.  La belleza de este método es su simplicidad y velocidad.  Después de que las bacterias hayan hecho la proteína de la fusión, lyse simplemente las, agregamos el extracto bacteriano del srude a una columna de afinidad del níquel, eliminamos todas las proteínas desatadas, después release/versión la proteína de la fusión con histidina o un imidazol llamado analogico de la histidina.  Este procedimiento permite que cosechemos esencialmente la fusión pura en solamente un paso de progresión.  Esto es posible porque muy poco si algunas proteínas naturales tienen regiones de la oligo-histidina, así que nuestra proteína de la fusión son esencialmente el único que ata a la columna.

¿Qué si queremos nuestro sin proteína de la etiqueta de la oligo-histidina? 

Los diseñadores de estos vectores han proporcionado cuidadosamente a una manera de quitarla.  Momentos antes del sitio múltiple de la reproducción, hay una región de la codificación para un estiramiento de los aminoácidos reconocidos por el enterokinase de la enzima proteolítica.  Podemos utilizar tan enterokinase para hender la proteína de la fusión en dos porciones:  la etiqueta de la oligo-histidina y la proteína que queremos. El sitio reconocido por enterokinase es muy raro, y la ocasión que exista en nuestra proteína es insignificante.  Así, nuestra proteína no debe ser tajada encima de mientras que estamos quitando su etiqueta de la oligo-histidina.  Si queremos, podemos funcionar con la proteína enterokinase-hendida a través de la columna del níquel una vez más para separar los fragmentos oligos-hisitidine de la proteína del interés.

los fagos del λ también han servido como la base para los vectores de la expresión;  uno diseñado específicamente con este fin es λgt11.  Este fago contiene una región de control de la laca seguida por el gene del lacZ.  Los sitios de la reproducción están situados dentro del gene del lacZ, así que los productos de un gene insertado en este vector serán proteínas de la fusión con un arranque de cinta de la B-galactosidasa.
El vector λgt11 de la expresión se ha convertido en un vehículo popular para hacer y defender bibliotecas del cDNA.  λgt11 permite que defendamos un grupo de copias directamente para la expresión de la proteína derecha.  Los ingredientes principales requeridos para este procedimiento son biblioteca del cDNA en λgt11 y un antisuero dirigido contra la proteína del interés.
Plateamos nuestros fagos del λ con los varios separadores de millares del cDNA y borramos las proteínas release/versión por cada copia sobre una ayuda tal como nitrocelulosa.  Una vez que hemos transferido las proteínas de cada placa a la nitrocelulosa, sondamos con nuestro antisuero.  Después, buscamos el anticuerpo limitado a la proteína de una placa determinada, usando la proteína etiquetada A del estafilococo áureo.  Esta proteína ata firmemente al anticuerpo y etiqueta el punto correspondiente en la nitrocelulosa.  Detectamos esta escritura de la etiqueta por autoradiografía o phosphorimaging, después vamos a nuestra placa principal y escogemos la placa correspondiente.  Observe que nosotros están detectando una proteína de la fusión, no la proteína de interés sí mismo.  Además, no importa si hemos reproducido un cDNA entero o no.  Nuestro antisuero es una mezcla de anticuerpos que reaccionen con varias diversas partes de nuestra proteína, tan incluso un gene parcial hará, mientras su región de la codificación se reproduzca en el mismo marco de la orientación y de lectura que la región de la codificación de la B-galactosidasa.

Para una revisión recombinante rápida de la expresión de la proteína vea:

Sistemas recombinantes de la proteína

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