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Expresión Recombinant De la Proteína

Estación © Molecular 2006 Del Copyright

Cuando usted desea caracterizar un gene o una proteína del interés, usted debe primero estudiar su función. En esta era molecular, la obtención de una DNA de su gene del interés no es difícil.

Para expresar la DNA como proteína, el IE una proteína recombinant, una puede entonces realizar fácilmente estudios funcionales usando la proteína purificada recombinant.

Una vez que usted tenga una proteína purificada usted puede conducir:

• Experimentos De la Interacción De la Protei'na-protei'na
• Cinética De la Enzima
• Estudios funcionales de la proteína
• Estudios estructurales - incluyendo la cristalización de la proteína, la estructura de la proteína y NMR.
• Usted puede también utilizar la proteína para hacer los anticuerpos para otros experimentos.

Hay dos sistemas principales para la expresión de la proteína recombinant. Una vez que usted consiga su DNA reproducida, usted debe decidir donde usted desea amplificar su proteína. Esto será (generalmente un sistema prokaryotic (bacteriano) o eukaryotic de la levadura o de la célula mamífera). La opción de su sistema decidirá en a qué vector usted necesitará reproducir su DNA pues hay diversos promotores que funcionan en E.Coli y otros que trabajan lo más mejor posible con levadura o sistemas mamíferos.

¿Tan que el sistema de la expresión de la proteína usted utilizaron?

 Sistemas para la expresión de la proteína

Sistemas De la Expresión De la Proteína De Prokaryotic

Los sistemas recombinant de la expresión de la proteína de Prokaryotic tienen varias ventajas. Éstos incluyen la facilidad de la cultura, y el significado muy rápido del crecimiento de la célula que usted no tendrá que esperar de largo para conseguir la proteína de sistemas bacterianos una vez que usted reproduzca su DNA. La expresión se puede inducir fácilmente en sistemas bacterianos de la expresión de la proteína usando IPTG. También, la purificación es absolutamente simple en sistemas prokaryotic de la expresión y hay una plétora de kits comerciales disponibles para la expresión recombinant de la proteína.

Por otra parte, si usted necesita utilizar sus proteínas para los estudios funcionales o enzimáticos los sistemas prokaryotic son un problema como la mayoría de las proteínas llegan a ser insolubles en cuerpos de la inclusión y son muy difíciles de recuperarse como proteínas funcionales. Además, la mayoría si no todas las modificaciones poste-de translacio'n no son agregadas por las bacterias y por lo tanto su proteína del interés puede no ser funcional. Los estudios enzimáticos así pueden ser estériles.

Sistemas De la Expresión De Eukaryotic

Los genes de Eukaryotic no están realmente “en el país” en células prokaryotic, incluso cuando se expresan bajo control de los vectores prokaryotic.  Una razón es que las células del E. coli reconocen los productos de la proteína de genes eukaryotic reproducidos como forasteros y los destruyen con frecuencia.  Otro es que los prokaryotes no realizan las mismas clases de modificación del posttranslational que lo hacen los eukaryotes.  Por ejemplo, una proteína que sería juntada ordinariamente a las azúcares en una célula eukaryotic será expresada como proteína descubierta cuando está reproducida en bacterias.  Esto puede efectuar una actividad’o una estabilidad de la proteína s, o por lo menos su respuesta a los anticuerpos.  Un problema más serio es que el interior de una célula bacteriana no está como conducente al plegamiento apropiado de proteínas eukaryotic como el interior de una célula eukaryotic.  Con frecuencia, el resultado plegable incorrectamente, los productos inactivos de genes reproducidos. 

Los sistemas de Eukaryotic para la expresión de la proteína incluyen:

• levadura
• células mamíferas
• células del baculovirus (insecto)

Todos estos sistemas son grandes sistemas eukaryotic para la expresión de proteínas recombinant.
Las ventajas de los sistemas eukaryotic de la expresión de la proteína incluyen el hecho de que usted puede conseguir niveles muy altos de la expresión. Las proteínas son fáciles de purificar con las etiquetas especiales que son incluidas en los vectores incluyendo el suyo, Myc y otras etiquetas.

Usted puede incluso comprar los plasmids que secretan su proteína en los media. Por lo tanto usted puede guardar el crecer de su sistema y el recoger de los media sin lysing sus células. No hay cuerpos de la inclusión a preocuparse alrededor y sus proteínas tienen modificaciones poste-de translacio'n intactas. Éstos son vitales si usted está estudiando la función de las interacciones de una proteína y/o de la protei'na-protei'na.

Las desventajas de los sistemas eukaryotic de la expresión de la proteína incluyen el hecho de que las células eukaryotic crecen más lentas que las células prokaryotic.

Vectores de la expresión con los promotores fuertes

La función principal de un vector de la expresión es rendir el producto de un gene generalmente, más el producto el mejor.  Por lo tanto, los vectores de la expresión se equipan ordinariamente de los promotores muy fuertes; el análisis razonado es que se produce cuanto más mRNA, más el producto de la proteína será hecho.
Un tal promotor fuerte es el promotor del trp (operon del tryptophan).  Forma la base para varios vectores de la expresión, incluyendo ptrpL1.  Hace una región del trp promoter/operator, seguir por un sitio obligatorio del ribosome, y puede ser utilizado directamente como vector de la expresión insertando un gene no nativo en el sitio de ClaI. Alternativomente, la región del control del trp puede ser hecha “portable” cortándolo hacia fuera con ClaI e HindIII e insertándolo delante de un gene que se expresará en otro vector

Vectores Inducible De la Expresión

Es generalmente ventajoso guardar un gene reproducido represed hasta que somos listos expresarlo.  Una razón es que las proteínas eukaryotic producidas en cantidades grandes en bacterias pueden ser tóxicas.  Incluso si estas proteínas no son realmente tóxicas, pueden aumentaron hasta los grandes niveles de auch que interfieren con crecimiento bacteriano.  En cualquier caso, si el gene reproducido fuera permitido seguir girado constantemente, las bacterias que llevan el gene nunca vendrían bastante una gran concentración para producir cantidades significativas de producto de la proteína.  La solución es mantener el gene reproducido dado vuelta apagado colocándolo río abajo de un promotor inducible que pueda ser dado vuelta apagado.
El promotor de la laca es inducible hasta cierto punto, probablemente restante apagado hasta estimulado por el isopropylthiogalactoside sintetizado del inductor (IPTG).  Sin embargo, la represión causada por el represor de la laca es incompleta, y una cierta expresión del gene reproducido será observada incluso en ausencia del inductor.  Una forma alrededor de este problema es expresar nuestro gene en un plasmid o un phagemid que lleve su propio gene del lacI, como lo hacen los pBS.  Exceso del represor producido por tal vector mantiene nuestro gene reproducido dado vuelta apagado hasta que somos listos inducirlo con IPTG.
Otra estrategia es utilizar a un promotor firmemente controlado como λ el promotor phage PL. Los vectores de la expresión con este sistema de promoter/operator se reproducen en las células huesped que llevan un gene λ temperatura-sensible del represor (c1857).  Mientras mantenemos la temperatura de estas células relativamente baja (32°C), el represor funciona, y ninguna expresión ocurre.  Sin embargo, cuando levantamos la temperatura al nivel nonpermissive (42ºC), el represor temperatura-sensible no conserve ninguna función más larga y el gene reproducido se induce.

Vectores de la expresión que producen las proteínas de la fusión

Cuando la mayoría de los vectores de la expresión funcionan, producen las proteínas de la fusión.  Esto pudo al principio parecerse una desventaja porque el producto natural del gene insertado no se hace.  Sin embargo, los aminoácidos adicionales en la proteína de la fusión pueden ser una gran ayuda en la purificación del producto de la proteína.

Considere los vectores de la expresión del oligo-oligo-histidine, uno de los cuales tiene los pTrcHis del nombre comercial.  Éstos tienen una secuencia corta apenas contracorriente desde el sitio múltiple de la reproducción que codifica un estiramiento de seis histidines.  Así, una proteína expresada en tal vector será una proteína de la fusión con seis histidines en su extremo amino.  ¿Por qué desearíamos asociar seis histidines a nuestra proteína?  las regiones del Oligo-oligo-histidine como esto tienen una alta afinidad para los metales como el níquel, así que podemos purificar las proteínas que tienen tales regiones usando la cromatografía de la afinidad del níquel.  La belleza de este método es su simplicidad y velocidad.  Después de que las bacterias hayan hecho la proteína de la fusión, lyse simplemente las, agregamos el extracto bacteriano del srude a una columna de la afinidad del níquel, eliminamos todas las proteínas desatadas, después release/versión la proteína de la fusión con histidine o un imidazole llamado analogico del histidine.  Este procedimiento permite que cosechemos esencialmente la fusión pura en solamente un paso de progresión.  Esto es posible porque muy poco si algunas proteínas naturales tienen regiones del oligo-oligo-histidine, así que nuestra proteína de la fusión son esencialmente el único que ata a la columna.

¿Qué si deseamos nuestro sin proteína de la etiqueta del oligo-oligo-histidine? 

Los diseñadores de estos vectores han proporcionado cuidadosamente a una manera de quitarla.  Momentos antes del sitio múltiple de la reproducción, hay una región de la codificación para un estiramiento de los aminoácidos reconocidos por el enterokinase proteolytic de la enzima.  Podemos utilizar tan enterokinase para hender la proteína de la fusión en dos porciones:  la etiqueta del oligo-oligo-histidine y la proteína que deseamos. El sitio reconocido por enterokinase es muy raro, y la ocasión que exista en nuestra proteína es insignificante.  Así, nuestra proteína no debe ser tajada encima de mientras que estamos quitando su etiqueta del oligo-oligo-histidine.  Si deseamos, podemos ejecutar la proteína enterokinase-hendida a través de la columna del níquel una vez más para separar los fragmentos del oligo-hisitidine de la proteína del interés.

λ los phages también han servido como la base para los vectores de la expresión;  uno diseñado específicamente para este propósito es λgt11.  Este phage contiene una región del control de la laca seguida por el gene del lacZ.  Los sitios de la reproducción están situados dentro del gene del lacZ, así que los productos de un gene insertado en este vector serán proteínas de la fusión con un arranque de cinta del B-b-galactosidase.
El vector gt11 λde la expresión se ha convertido en un vehículo popular para hacer y defender bibliotecas de la DNA.  λgt11 permite que defendamos a grupo de se reproduce directamente para la expresión de la proteína derecha.  Los ingredientes principales requeridos para este procedimiento son biblioteca de la DNA en λgt11 y un antisuero dirigido contra la proteína del interés.
Plateamos nuestros λ phages con los varios separadores de millares de la DNA y borramos las proteínas release/versión por cada copia sobre una ayuda tal como nitrocelulosa.  Una vez que hayamos transferido las proteínas de cada placa a la nitrocelulosa, sondamos con nuestro antisuero.  Después, buscamos el anticuerpo limitado a la proteína de una placa determinada, usando la proteína etiquetada A del estafilococo áureo.  Esta proteína ata firmemente al anticuerpo y etiqueta el punto correspondiente en la nitrocelulosa.  Detectamos esta escritura de la etiqueta por autoradiografía o phosphorimaging, entonces vamos a nuestra placa principal y escogemos la placa correspondiente.  Observe que nosotros están detectando una proteína de la fusión, no la proteína de interés sí mismo.  Además, no importa si hemos reproducido una DNA entera o no.  Nuestro antisuero es una mezcla de los anticuerpos que reaccionarán con varias diversas partes de nuestra proteína, tan incluso un gene parcial hará, mientras su región de la codificación se reproduce en el mismo marco de la orientación y de la lectura que la región de la codificación del B-b-galactosidase.

Para una revisión recombinant rápida de la expresión de la proteína vea:

Sistemas Recombinant De la Proteína

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