Hibridación de la membrana para defender una biblioteca

Bibliotecas de la investigación usando el hibridación de la membrana

Bajo condiciones de la temperatura y del ion la concentración encontró en las células, DNA es mantenida en una estructura (dos-trenzada) a dos caras por los enlaces de hidrógeno que forman entre las bases de A y de T y las bases de G y de C en cada hilo. Los duplex de la DNA se pueden desnaturalizar en solos hilos calentándolos, generalmente en una solución de sal diluída (e.g., NaCl de 0.01 M), o levantando el pH sobre 11. Si se baja la temperatura y la concentración del ion en la solución se levanta, o si el pH se baja a la reforma baja de los pares de la neutralidad, EN y de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA entre los solos hilos complementarios.

Este proceso va por muchos nombres: renaturalización, reasociación, hibridación, destemplando. En una mezcla de ácidos nucléicos, solamente los solos hilos complementarios (o los hilos que contienen regiones complementarias) reasociarán; el fragmento de su reasociación es virtualmente inafectado por la presencia de hilos noncomplementary. Tal hibridación molecular puede ocurrir entre dos hilos complementarios de DNA o de ARN, o entre un hilo del ARN y un hilo de la DNA. Para utilizar el hibridación molecular en la detección de copias específicas de la DNA, la sola DNA trenzada de las moléculas de la DNA recombinante se asocia a una ayuda sólida, comúnmente un filtro de la nitrocelulosa o una membrana de nylon tratada. Cuando una solución que contiene los ácidos nucléicos de single0stranded se seca en tal membrana, los solos hilos irreversible se limitan a la ayuda sólida de una forma que sale la mayor parte de de las bases disponibles para el hibridación para un hilo complementario. Aunque la química si este atascamiento irreversible no es haber entendido bien, el procedimiento sea muy útil. La membrana entonces se incuba en una solución que contiene la DNA de una sola fila radiactivo etiquetada (o el ARN) que es complementaria a algo del ácido nucléico limitado a la membrana.

Bajo condiciones del hibridación (cerca de pH neutral, 40-65 C, NaCl de 0.3-0.6 M), esta punta de prueba etiquetada cruza por hibridación al ácido nucléico complementario limitado a la membrana. Se quita cualquier exceso de punta de prueba que no cruce por hibridación, y los híbridos etiquetados es detectada por la autoradiografía del filtro. Los virions recombinantes del lamda presentes en placas de un césped de Escherichia Coli son transferidos a una membrana de nylon colocando la membrana en la superficie del plato de petri. Muchas de las partículas virales en cada placa absorben a la superficie de la membrana, pero muchos virions permanecen en las placas en la superficie del agar nutriente en el plato de petri que contiene una gran cantidad de copias individuales del lamda se reproducen en la superficie de la membrana.

El plato de petri de la original se refrigera para salvar la colección de copias del lamda. La membrana entonces se incuba en una solución alcalina, que interrumpe los virions, release/versión y desnaturalizando la DNA encapsulada. La membrana entonces se seca, fijando la DNA recombinante del lamda a la superficie de la membrana. Después, la membrana se incuba con una punta de prueba radiactiva bajo condiciones del hibridación. Se quita la punta de prueba de Unhybridized, y el filtro se sujeta a la autoradiografía.

El aspecto de un punto en el autoradiogram indica la presencia de una copia recombinante del lamda que contiene la DNA complementaria a la punta de prueba. La posición del punto respecto al autoradiogram corresponde a la posición respecto al plato de petri original donde esa copia determinada formó una placa. Puesto que el plato de petri original todavía contiene muchos virions del infectioua en cada placa, las partículas virales de la copia identificada se pueden recuperar para substituir alineando el autoradiogram y el plato de petri y quitando partículas virales de la copia que corresponde al punto. Una técnica similar puede ser aplicada para defender una biblioteca del plásmido en las células de Escherichia Coli.