Secuencia de Maxam Gilbert

Cómo se ordena la DNA

DNA que ordena usando el método de Maxam-Gilbert

Maxam-Gilbert que ordena con este método de DNA que ordena en vez de sintetizar la DNA in vitro y de parar las reacciones de la síntesis con los adaptadores de cadena, este método comienza con integral, termina la DNA etiquetada y la hiende con los reactivo específicos bajos. Tan cómo este método trabaja con las bases de la guanina, solamente el mismo principio se aplica a las cuatro bases; Primero fin-etiquetamos un fragmento de la DNA que queremos ordenar.

Éste puede ser 5 ' - o 3 ' - termina el etiquetado. Después, modificamos una clase de base. Aquí utilizamos el sulfato dimethyl (DMS) para desnaturalizar las guaninas. (Realmente, este reactivo también desnaturaliza adenines, pero no de una manera ése lleva a la hendidura del hilo de la DNA.) Como en el método de cadena del fin, no queremos afectar a cada guanina, o produciremos solamente los fragmentos minúsculos que no permitirán que determinemos la secuencia de la DNA. Por lo tanto, hacemos la metilación bajo condiciones suaves que lleven a un promedio de solamente una guanina desnaturalizada por hilo de la DNA. Después, utilizamos un reactivo (piperidina) que haga dos cosas: causa la pérdida de la base desnaturalizada, después rompe la espina dorsal de la DNA en el sitio de la base perdida (el sitio apurinic). En este caso, el G en el medio de la secuencia fue desnaturalizado, así que la rotura del hilo ocurrió allí, produciendo un trímero etiquetado.

En otra molécula de la DNA, el primer G no se podría desnaturalizar, dando lugar a un fosfato etiquetado (la base y el azúcar serían perdidos en las hendiduras químicas). Finalmente, electrophorese los productos y las detectamos por autoradiografía, apenas como en el método del encadenamiento-fin. Por supuesto, necesitamos ejecutar tres otras reacciones que hiendan en las otras tres bases. Hay varias maneras de hacer esto. Por ejemplo, podemos debilitar los enlaces del glucósido a la adenina y a la guanina con el ácido; entonces la piperidina causará la despurinación y la rotura del hilo después de ambos como y del Gs. Si electrophorese esto reacción de A + de G al lado de la reacción de G solamente, nosotros podemos obtener como por la comparación. Semejantemente, la hidracina abre los anillos del thymine y de la citosina, y la piperidina puede después quitar estas bases y romper el hilo de la DNA en los sitios resultantes del apyrumidine. En presencia del NaCl del 1M, la hidracina es específica para la citosina solamente, así que podemos ejecutar esta reacción al lado de la reacción de C+T y obtener los Ts por la comparación.

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