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Spectrometry Total

¿Cuál es un espectrómetro total?

Un espectrómetro total se basa en el hecho simple de que diversos productos químicos tienen diversas masas, y esto es qué se determina qué productos químicos están presentes en una muestra. Hay muchos tipos de espectrómetros totales que no solamente analizar los iones diferentemente sino producir diversos tipos de iones; sin embargo todos utilizan los campos eléctricos y magnéticos cambiar el camino de iones de una cierta manera.

Durante el final de los '80 y los años 90 tempranos, dos nuevos métodos de ionización de la muestra hicieron spectrometry total experimentar una revolución en el análisis del biopolímero, a saber ESI 38 y MALDI.39 apenas sobre hace una década, para la primera vez, las técnicas spectrometric totales que podrían medir las masas moleculares de las cantidades del femtomole de proteínas en el exceso del kDa 100, mejorar a menudo que 0.01% exactitud, llegó a estar extensamente disponible para los químicos de la proteína. Estos métodos son ambo acertados en la formación de los iones de biomoléculas grandes, labile sin la degradación significativa del analyte. Son no sólo ambas técnicas sensibles sino que de la secuencia rápida – también los espectros del MS y de MS/MS se pueden adquirir dentro de segundos. ESI y MALDI, debido a sus muchas diferencias, son complementarios y muchos laboratorios del biopolímero tienen acceso a ambas técnicas.

Preparación de la muestra: electrophoresis 2-Dimensional y spectrometry total

La separación, el aislamiento y la preparación de la muestra para las técnicas spectrometric totales generalmente, implica 2-DE (2-Dimenisional electrophoresis), una técnica que pueda separar tanto como 5000 diversas proteínas en un solo experimento. En general, 2-DE es capaz de separar las proteínas dentro de un rango isoeléctrico de la punta (pi) de 3.5–10 y de las masas moleculares que se extienden a partir del 6 al kDa 300, tan bien como pudiendo distinguir entre las proteínas modificadas poste-translationally (e.g. phosphorylated) y sus compañeros no-modificados. Una vez que estén separados, los componentes de proteína sean revelados por las técnicas que se manchan (e.g. mancha de plata, mancha fluorescente, azul de Coomassie) y localizado una vez pueden entonces ser extraídos del gel. Las proteínas no se pueden enjuagar fácilmente de los geles sin el uso de los detergentes, que son perjudiciales al análisis spectrometric total; además, las proteínas grandes tienden para ser heterogéneas (e.g. como resultado del glycosylation) y así que no poseen ninguna masa molecular que se pueda relacionar con la entrada correspondiente en una base de datos. Para superar estos obstáculos, el paso de progresión del elution tiende para ser logrado después de que la proteína haya sido digerida por una colada acuosa del acetonitrile de un pedazo suprimido del gel. Esto aumenta la producción de la extracción 5 y usando un método de la digestión del en-gel que emplea el trypsin, que se ha descrito y se utiliza extensamente según lo publicado o con modificaciones de menor importancia, produce una muestra Ms-compatible de la cual una identificación de la proteína pueda ser hecha. El paso de progresión de la digestión se puede preceder por un paso de progresión opcional de la reducción y del alkylation para hender y para bloquear los puentes del disulfuro que existen entre los residuos del cysteine. Los sistemas robóticos se han desarrollado para automatizar la supresión de los puntos de la proteína del 2D-gel, para realizar la digestión enzimática subsecuente y transferir las muestras sobre MALDI-MS apunte las placas para el análisis inicial del MS. Para muchas aplicaciones, los peptides recuperados de digestiones del en-gel requieren la concentración y la purificación antes de ser analizado por spectrometry total especialmente si ESI es el método de la ionización usado. Líquido inverso del alto rendimiento
la cromatografía (HPLC) es un método de alcanzar esto; otro método implica el uso material de la perfusión de ZipTips (millipore) (extremidades de la pipeta pila de discos con el material C18) o de Poros R2 (biosistemas de Perseptive). A pesar de su aceptación extensa, las limitaciones de 2-DE incluyen la exclusión de proteínas muy pequeñas o muy grandes, de proteínas muy ácidas o muy básicas, así como las proteínas hidrofóbicas tales como proteínas de la membrana. Se piensa eso
el solamente 20% de las proteínas gel-cargadas pueden ser visualizados y ser analizados. Otros apremios son que la cantidad de muestra que puede ser cargada es limitada causando el incumplimiento de
las proteínas bajas de la concentración y también eso las técnicas que se manchan lo más comúnmente posible usadas tienen factores no lineares de la respuesta. En la práctica, 2-DE es un proceso intensivo de trabajo que implica los pasos de progresión del trabajo manual que ofrecen la oportunidad para las impurezas tales como queratina de contaminar las muestras. Un 2.o gel tomará un día para terminar y cerca de un mes para un análisis estructural completo del MS, aunque la automatización puede ayudar al problema de contaminación y acelerar el análisis a un cierto fragmento.

Técnicas alternativas de la separación de la proteína

El alternativa, los métodos Ms-compatibles de preparación de la proteína está en el desarrollo pero nadie tecnología ha emergido como reemplazo universal. Estos métodos apuntan generalmente interconectar la muestra de la proteína directamente a los análisis de MS/MS de tal modo que eliminan pasos de progresión desperdiciadores de tiempo de la preparación de la muestra y la necesidad de un análisis preliminar del MS. El enfocarse isoeléctrico capilar (CIEF)-MS y el enfocarse isoeléctrico preparatorio seguidos por el cromatografi'a-Ms de la exclusión de la talla son los métodos que se han comparado en profundidad con 2-DE en términos del effciency de la separación, de la capacidad máxima, de la precisión y de la robustez, con anterior aparecer el alternative.The más favorable dirigen el análisis de las mezclas complejas del peptide de una mezcla de proteínas usando en línea, cromatografía líquida inversa del alto rendimiento (HPLC)-MS/MS se ha utilizado con éxito mientras que un alternativa a 2DE y a éste ha conducido sobre la cromatografía multidimensional si la mayor separación del peptide es deseable antes de los análisis de MS/MS. Los ejemplos de la cromatografía de dos dimensiones incluyen el intercambio catiónico del anión o seguido por la cromatografía inversa de la exclusión del HPLC y de la talla seguida por el HPLC inverso. Otro, acercamiento alternativo ha sido utilizar la micro-extraccio'n solid-phase combinada junto con el tubo capilar electrophoresis(CE) juntado a ESI MS/MS para el análisis de un resumen tryptic de la proteína total. Este método produjo la separación de alta resolución de los fragmentos del peptide permitiendo la identificación de 80–90% de las proteínas en este complejo determinado del ribosome de la levadura. Juntar los dispositivos microfluidic al MS es otra estrategia que combina la dirección y la separación de la muestra, así como la interconexión cuidadosamente con diverso acercamiento del nano-ESI-Ms analysis.A para el fraccionamiento selectivo de la proteína y la identificación utiliza la tecnología de ProteinChip (Ciphergen) que emplea un método superficial de la captura usando los anticuerpos o las superficies químicamente modificadas para capturar clases específicas de las proteínas que entonces son analizadas por MALDI-MS. Esta técnica, conocida como superficie realzó la ionización de la desorción del laser (SELDI)-MS35, tiene gran potencial para la comparación del contenido proteínico de diversas muestras.