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Un espectrómetro total se basa en el simple hecho de que diversos productos químicos tienen diversas masas, y esto es qué determina qué productos químicos están presentes en una muestra. Hay muchos tipos de espectrómetros totales que no sólo analicen los iones diferentemente pero produce diversos tipos de iones; sin embargo todos utilizan eléctrico y los campos magnéticos para cambiar el camino de iones de cierta manera.
Durante el finales de los 80 y el principio de los 90, dos nuevos métodos de ionización de la muestra hicieron espectrometría total experimentar una revolución en el análisis del biopolímero, a saber ESI 38 y MALDI.39 apenas durante hace una década, por primera vez, las técnicas espectrométricas de la masa que podrían medir las masas moleculares de las cantidades del femtomole de proteínas superior al kDa 100, mejorar a menudo que 0.01% exactitudes, estaba extensamente - disponible para los químicos de la proteína. Estos métodos son ambo acertados en la formación de los iones de biomoléculas grandes, inestables sin la degradación significativa del analito. No sólo son ambas técnicas sensibles pero también rápido - los espectros de la secuencia del ms y de MS/MS se pueden adquirir dentro de segundos. ESI y MALDI, debido a sus muchas diferencias, son complementarios y muchos laboratorios del biopolímero tienen acceso a ambas técnicas.
La separación, el aislamiento y la preparación de la muestra para las técnicas espectrométricas totales generalmente, implica 2-DE (2-Dimenisional electroforesis), una técnica que pueda separar tanto como 5000 diversas proteínas en un solo experimento. 2-DE es generalmente capaz de separar las proteínas dentro de un rango isoeléctrico de la punta (pi) de 3.5-10 y de las masas moleculares que se extienden a partir del 6 al kDa 300, tan bien como pudiendo distinguir entre las proteínas modificadas poste-de translación (e.g. phosphorylated) y sus compañeros no-modificados. Una vez que están separados, los componentes de proteína son revelados por las técnicas de coloración (e.g. mancha de plata, mancha fluorescente, azul de Coomassie) y localizado una vez pueden entonces ser extraídos del gel. Las proteínas no se pueden enjuagar fácilmente de los geles sin el uso de los detergentes, que son perjudiciales al análisis espectrométrico total; además, las proteínas grandes tienden a ser heterogéneas (e.g. como resultado del glycosylation) y así que no poseen ninguna masa molecular que se pueda relacionar con la entrada de correspondencia en una base de datos. Para superar estos obstáculos, el paso de progresión de la elución tiende a ser logrado después de que la proteína haya sido digerida por una colada acuosa del acetonitrilo de un pedazo suprimido del gel. Esto aumenta la producción de la extracción 5 y usando un método de la digestión del en-gel que emplea la tripsina, que se ha descrito y es ampliamente utilizada según lo publicado o con modificaciones de menor importancia, produce una muestra Ms-compatible de la cual una identificación de la proteína pueda ser hecha. El paso de progresión de la digestión se puede preceder por un paso de progresión opcional de la reducción y de la alcohilación para hender y para bloquear los puentes de disulfuro que existen entre los residuos de la cisteína. Los sistemas robóticos se han desarrollado para automatizar la supresión de los puntos de la proteína del 2D-gel, para realizar la digestión enzimática subsecuente y transferir las muestras sobre MALDI-MS apunte las placas para el análisis inicial del ms. Para muchas aplicaciones, los péptidos recuperados de digestiones del en-gel requieren la concentración y la purificación antes de ser analizado por espectrometría total especialmente si ESI es el método de la ionización usado. Líquido inverso del alto rendimiento
la cromatografía (CLAR) es un método de alcanzar de esto; otro método implica el uso material de la perfusión de ZipTips (Millipore) (extremidades de la pipeta pila de discos con el material C18) o de Poros R2 (biosistemas de Perseptive). A pesar de su aceptación extensa, las limitaciones de 2-DE incluyen la exclusión de proteínas muy pequeñas o muy grandes, de proteínas muy ácidas o muy básicas, así como las proteínas hidrofóbicas tales como proteínas de la membrana. Se piensa eso
el solamente 20% de las proteínas gel-cargadas pueden ser visualizados y ser analizados. Otros apremios son que la cantidad de muestra que puede ser cargada es limitada causando el incumplimiento de
las proteínas bajas de la concentración y también eso las técnicas de coloración más de uso general tienen factores de respuesta no lineares. En la práctica, 2-DE es un proceso necesitando mucho trabajo que implica los pasos de progresión del trabajo manual que ofrecen la oportunidad para las impurezas tales como queratina de contaminar las muestras. Un 2.o gel tardará un día para terminar y cerca de un mes para un análisis estructural completo del ms, aunque la automatización pueda ayudar al problema de contaminación y acelerar el análisis hasta cierto punto.
La alternativa, los métodos Ms-compatibles de preparación de la proteína está en el desarrollo pero nadie tecnología ha emergido como reemplazo universal. Estos métodos apuntan generalmente interconectar la muestra de la proteína directamente a los análisis de MS/MS de tal modo que eliminan pasos de progresión desperdiciadores de tiempo de la preparación de la muestra y la necesidad de un análisis preliminar del ms. La concentración isoeléctrica capilar (CIEF) - ms y la concentración isoeléctrica preparatoria seguida por la exclusión chromatography-MS de la talla son los métodos que han sido profundizados comparado con 2-DE en términos de effciency de la separación, capacidad máxima, precisión y robustez, con anterior aparecer la alternativa más favorable. El análisis directo de las mezclas complejas del péptido de una mezcla de proteínas usando la cromatografía líquida en línea, inversa del alto rendimiento (CLAR) - MS/MS se ha utilizado con éxito mientras que una alternativa a 2DE y a éste ha llevado sobre la cromatografía multidimensional si la mayor separación del péptido es deseable antes de los análisis de MS/MS. Los ejemplos de la cromatografía de dos dimensiones incluyen el intercambio catiónico del anión o seguido por la cromatografía inversa de la exclusión de la CLAR y de la talla seguida por la CLAR inversa. Otro, acercamiento alternativo ha sido utilizar la micro-extracción solid-phase combinada junto con la electroforesis capilar (CE) juntada a ESI MS/MS para el análisis de un resumen tríptico de la proteína total. Este método produjo la separación de alta resolución de los fragmentos del péptido permitiendo la identificación de 80-90% de las proteínas en este complejo determinado del ribosoma de la levadura. El acoplamiento de los dispositivos microfluidic al ms es otra estrategia que combina la muestra que dirige y separación, así como la interconexión cuidadosamente con el análisis nano-ESI-MS. Un diverso acercamiento para el fraccionamiento y la identificación selectivos de la proteína utiliza la tecnología de ProteinChip (Ciphergen) que emplea un método superficial de la captura usando los anticuerpos o las superficies químicamente modificadas para capturar clases específicas de proteínas que entonces sean analizadas por MALDI-MS. Esta técnica, conocida como ionización realzada superficie de la desorción del laser (SELDI) - MS35, tiene gran potencial para la comparación del contenido proteínico de diversas muestras.
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