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Degradación Automatizada De Edman

Las secuencias del aminoácido se pueden determinar por la degradación automatizada de Edman

La composición de aminoácido del peptide se determina.  El peptide es hidrolizado en su aminoácido constitutivo calentándolo en 6 N HCl en 110°C por 24 horas.  Stanford Moore y Guillermo Stein mostraron que los aminoácidos en hydrolysates se pueden separar por cromatografía del ionexchange en columnas de sulfonated el poliestireno y cuantificado reaccionándolas con ninhydrin. 

Los aminoácidos trataron esta elasticidad de la manera un color azul intenso, a excepción de la almendra garapiñada, que da un color amarillo porque contiene a grupo amino secundario.  La concentración del aminoácido en una solución es proporcional a la absorbencia óptica de la solución después de la calefacción él con ninhydrin.  Esta técnica puede detectar un microgramo (10nmol) de un aminoácido, que está sobre la cantidad presente en un thumbprint. 

Tan poco como un nanogram (pmol 10) de un aminoácido se puede detectar por medio del fluorescamine, que reacciona con el grupo uno-amino de un producto altamente fluorescente.  La identidad del aminoácido es revelada por su volumen del elution, que en el volumen del almacenador intermediario quitaba el aminoácido de la columna. 

El residuo de la amino-terminal de una proteína o de un peptide puede ser identificado etiquetándolo con un compuesto que forme una conexión covalente estable. 

Fluorodinitrobenzene (FDNB) primero fue utilizado para este propósito por Frederick Sanger.  El cloruro de Dabsyl ahora se utiliza comúnmente porque forma los derivados intenso coloreados que se pueden detectar con alta sensibilidad.  Reacciona con un grupo uncharged a-NH2 para formar un derivado de la sulfamida que sea estable bajo condiciones que hidrolicen enlaces del peptide. 

Aunque el método del dabsyl para determinar el residuo de la amino-terminal es sensible y de gran alcance, no puede ser utilizado en varias ocasiones en el mismo peptide porque el peptide se degrada totalmente en el paso de progresión de la a'cido-hidro'lisis.  Pehr Edman ideó un método para etiquetar el residuo de la amino-terminal y el hendimiento de él del peptide sin la interrupción del peptide pega entre los otros residuos del aminoácido.  La degradación de Edman quita secuencialmente un residuo al mismo tiempo del extremo amino de un peptide.  El isotiocianato fenilo reacciona con el grupo amino terminal uncharged del peptide para formar un derivado del phenylthiocarbamoyl.  Entonces, bajo condiciones ácidas mildy, un derivado cíclico del aminoácido terminal se libera, que sale de un peptide intacto acortado por un aminoácido.

Los análisis de las estructuras de la proteína han sido acelerados marcado por el desarrollo de los sequenators, que son instrumentos automatizados para la determinación de la secuencia del aminoácido.  En un sequenator liquid-phase, una película fina de la proteína en una taza cilíndrica que hace girar se sujeta a la degradación de Edman.  Los reactivo y los solventes el extraer se pasan sobre la película inmovilizada de la proteína, y el ácido PTH-amino release/versión es identificado por la cromatografía líquida de alta presión (también llamada cromatografía líquida, HPLC de alto rendimiento). 

Un ciclo de la degradación de Edman se realiza sobre menos de dos horas.  Por degradaciones relanzadas, la secuencia del aminoácido de unos cincuenta residuos en una proteína puede ser determinada.  Los sequenators en fase gaseosa pueden analizar cantidades del picomol de peptides y de proteínas.  Esta alta sensibilidad lo hace factible para analizar la secuencia de una muestra de la proteína enjuagada de una sola venda de un gel del SDS-sDS-polyacrylamide.