Apuro de Re-PCR

[Marina Ntika]

Hola cada uno.

Estoy intentando amplificar un gene, y en la misma época de introducir mutaciones de la punta, para permitir la digestión con una enzima específica del interés, con la última meta de reproducir mi gene en un plasmid específico.

Puesto que las mutaciones de la punta necesito son 5 (no podría encontrar un sitio más apropiado para diseñar las cartillas, causa que necesito permanecer en marco con ATG del blanco-target-plasmid) diseñé dos cartillas delanteras, los primeros con mutaciones de 3 puntas y el segundo que corresponde con el primer delantero, e introduciendo las dos mutaciones restantes. Utilizo la misma cartilla reversa para emparejar ambos mis remito.

La primera multa justa trabajada del par (cartilla delantera A y cartilla reversa), conseguí el producto que deseé, fácilmente y absolutamente claro (después de fino-templar el perfil conseguí solamente una venda, la derecha). Sin embargo, durante el re-PCR usando el producto que resulta anterior como modelo, y con el segundo par de las cartillas (cartilla delantera B y cartilla reversa), consigo 2 vendas, both.of.them extremadamente intensos y both.of.them absolutamente más bajos que previsto. Con una concentración más alta del mgCl2, conseguí también una tercera venda (deseada) pero es extremadamente débil. No puedo ser seguro si es también una cierta porción de la DNA del modelo que no reaccionó con las cartillas...

El modelo de la cantidad para el rePCR es 1ul.

La temperatura del recocido para ambo par de cartillas es 64C, pero tengo hasta 66 idos, y aún, los primeros trabajos del par, no en segundo lugar.

También, una nota rápida: Introducir las mutaciones por maneras alternas o seleccionar una diversa enzima para el procedimiento de la reproducción no es una opción.

Por favor, cualesquiera pistas y sugerencia son sobre todo agradables.

Apesadumbrado para el poste largo, y el thanx por adelantado.

[kmunson779]

¿Soy que lee correctamente que usted utilizó 1 uL de su primer producto de PCR como modelo para su segunda reacción? Esto se parece como una porción tremenda de DNA a mí.

¿Cómo usted purificó su DNA entre los dos pasos de progresión de PCR? ¿Cuánto DNA (en términos de topos o de gramos) usted está agregando a su segunda reacción de PCR?

¿Cuántos ciclos usted está ejecutando para las dos reacciones?

Le conozco opinión que usted no puede utilizar ninguna otra métodos, pero puede valer el embotado-extremo que reproduce el primer producto para verificar que tiene las mutaciones correctas antes de proceder.

También puede valer el diseñar de otra cartilla reversa fuera de la región que usted desea amplificar para la primera reacción de PCR, evitar problemas usted puede tener intentar re-primero con la misma cartilla.

[oBWhat]

Diluimos sí generalmente el 1uL de la reacción de PCR en 10ul del agua purificada y después utilizamos 1ul de eso para otro PCR, pues la mezcla de PCR puede inhibir su reacción también.

[Marina Ntika]

Fijado originalmente por kmunson779

¿Soy que lee correctamente que usted utilizó 1 uL de su primer producto de PCR como modelo para su segunda reacción? Esto se parece como una porción tremenda de DNA a mí.

¿Cómo usted purificó su DNA entre los dos pasos de progresión de PCR? ¿Cuánto DNA (en términos de topos o de gramos) usted está agregando a su segunda reacción de PCR?

¿Cuántos ciclos usted está ejecutando para las dos reacciones?

Le conozco opinión que usted no puede utilizar ninguna otra métodos, pero puede valer el embotado-extremo que reproduce el primer producto para verificar que tiene las mutaciones correctas antes de proceder.

También puede valer el diseñar de otra cartilla reversa fuera de la región que usted desea amplificar para la primera reacción de PCR, evitar problemas usted puede tener intentar re-primero con la misma cartilla.

Bien, no purifiqué realmente el primer producto de PCR antes de proceder segundo, causar mi venda estaba muy claro, y no tenía ningún otro producto, o borrón de transferencia. Sin embargo, planeo intentar otra vez y extraer el modelo para el segundo PCR a través de la extracción del gel, apenas en caso de que una venda no-visible se está amplificando también. El modelo que utilizo para el segundo PCR es ng cerca de 10-30. Ejecuto 40 ciclos.

Desafortunadamente, no tengo tiempo para reajustar y cartillas de la orden, causa que tengo que presentar mi trabajo del diploma el septiembre, y todavía tengo una segunda pieza de la reproducción (con el gene del INDICADOR) y entonces el gene entero (gene Indicador-inicial) debo ser reproducido en un vector dado de la expresión, hago un aislamiento de la escala grande y después voy in vivo. ¡Mi horario es extremadamente apretado!!! Esta carencia del tiempo, además del financiamiento pobre del proyecto conduce a mi inhabilidad de perseguir métodos alternativos. Imagínese que yo no tienen incluso la capacidad de utilizar kits, hago todos mis aislamientos la vieja manera formada, que es extremadamente desperdiciadora de tiempo.

De todas formas, gracias mucho por su contestación, también intentaré diluir mi primer producto 1:10 e intentar usar esto como modelo también, como el oBWhat sugiere (gracias también), y veo cómo va...