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La ciencia es la topografía de la ignorancia. ~Oliver Wendell Holmes, Sr., Ensayos Médicos, 1883
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El borrar meridional es una técnica nombrada después de su inventor y revelador, el biólogo británico Edwin M. Southern en 1975. El borrar meridional es una técnica que permite la detección de una secuencia específica de la DNA (gene u otro) en una muestra grande, compleja de la DNA (e.g. DNA celular).
"antes de PCR y barato ayuna ordenando cambió nuestra opinión del universo que es genéticas, la mancha blanca /negra meridional era un workhorse universal. No había un experimento en la genética molecular que en una determinada etapa no empleó una mancha blanca /negra meridional. Sigue siendo una herramienta útil y usted necesita saber sobre ella de modo que usted pueda interpretar datos históricos."
El diagrama de la mancha blanca /negra meridional technique.Figure es copyright. Si usted quisiera utilizarlo para un proyecto de la conferencia o de la ciencia, éntrenos en contacto con por favor para el permiso.
En el paso de progresión 1, la DNA se digiere con los endonucleases de la restricción. La DNA de peso molecular elevado se digiere en fragmentos más pequeños.
En el paso de progresión 2, La DNA entonces es separada hacia fuera por talla por electrophoresis en un gel del agarose.
En el paso de progresión 3, una hoja de la membrana del nilón o de la nitrocelulosa (púrpura) se coloca encima del gel del agarose en una solución tapón. Se considera esto la etapa que borra o de transferencia. La presión es aplicada uniformemente al gel usando la succión o colocando una pila de las toallas de papel y un peso encima de la membrana y del gel para asegurar incluso el contacto entre el gel y la membrana. La transferencia del almacenador intermediario por la acción capilar de una región del alto potencial del agua a una región del potencial bajo del agua (generalmente papel de filtro y los tejidos finos del papel) entonces se utiliza para mover la DNA desde el gel encendido a la membrana. La membrana positivamente cargada (púrpura) se utiliza generalmente que permite que la DNA ate con alta afinidad a la membrana con interacciones del ion entre la DNA negativamente cargada y la membrana positivamente cargada.
En el paso de progresión 4, las membranas de la nitrocelulosa son cocidas al horno por la exposición a las altas temperaturas (a partir el °C el 60 a 100). Las membranas de nylon se exponen a la radiación UV. Estos pasos de progresión se utilizan para asegurar la reticulación permanente y covalente de la DNA presente en las vendas a las membranas.
En el paso de progresión 5, la membrana se expone a una punta de prueba radiactiva. Esta punta de prueba es un fragmento solo-trenzado de la DNA que tiene su secuencia del interés que usted desee detectar. Esta punta de prueba se incuba con la membrana y se permite cruzar por hibridacio'n con la DNA en la membrana. Las puntas de prueba son generalmente radiactivas para poderlas detectar en la película, no obstante más nuevas puntas de prueba también se utilizan que son no radiactivas por ejemplo los tintes fluorescentes o chromogenic. Después del hibridación, exceso de la punta de prueba desatada se lava lejos de la membrana, saliendo de la punta de prueba específicamente limitada.
En el paso de progresión 6, el modelo del hibridación es detectado por la visualización en la película de radiografía de la autoradiografía en la caja de puntas de prueba radiactivas o fluorescentes, o del desarrollo del color en la membrana si se utiliza un método de detección chromogenic.
(notas para el paso de progresión 3: Si los
fragmentos grandes de la DNA están presentes mayor de 15 KB de
tamaño pueden ser depurinated para entonces el ácido diluído de HCl
antes de borrar que rompa la DNA en pedazos más pequeños, así
permitiendo una transferencia más eficiente del gel a la membrana.
Si se utilizan los métodos alcalinos de la transferencia, el
gel de la DNA se coloca en una solución alcalina (que contiene
típicamente el hidróxido del sodio) para desnaturalizar la DNA
double-stranded. La desnaturalización en un ambiente alcalino
preve el atascamiento mejorado de la DNA negativamente cargada a una
membrana positivamente cargada, la separa en los solos hilos de la DNA
para un hibridación más último a la punta de prueba (véase abajo),
y destruye cualquier RNA residual que pueda todavía estar presente en
la DNA.
AUDIO: ¡Escuche
una explicación meridional detallada de la mancha blanca
/negra! Cortesía:
Instituto De Investigación Humano Nacional Del Genoma.
Según lo mencionado, la mancha blanca /negra meridional es una técnica usada para identificar y para localizar las secuencias de la DNA que son complementarias a otro pedazo de DNA llamado una punta de prueba.
La separación en un gel electrophoretic de las secuencias o de los fragmentos de la DNA genomic o complementaria, digeridos parcialmente por los endonucleases, los fragmentos después ' se borra ' sobre una membrana y se permite cruzar por hibridacio'n con un específico, etiquetado punta de prueba para detectar qué vendas contienen el fragmento o el gene del interés. La mancha blanca /negra meridional es determinado útil en la detección del gene grande rearrangements/deletions y de extensiones grandes de la repetición del trinucleotide.
Una mancha blanca /negra meridional es un método usado rutinariamente en biología molecular para controlar para saber si hay la presencia de una secuencia de la DNA en una muestra de la DNA. El borrar meridional combina el electrophoresis del gel del agarose para la separación de la talla de la DNA con métodos para transferir la DNA talla-separada a una membrana del filtro para el hibridación de la punta de prueba. Otros métodos que borraban (es decir, mancha blanca /negra occidental, mancha blanca /negra norteña, mancha blanca /negra al sudoeste) que emplea principios similares, solamente usar el RNA o la proteína, se han nombrado más adelante en referencia al nombre meridional. Pues la técnica eponymously fue nombrada, la mancha blanca /negra meridional debe ser capitalizada, mientras que no deben las manchas blancas /negras norteñas y occidentales.
También se utiliza para determinar el peso molecular de un fragmento de la restricción y para medir cantidades relativas en diversas muestras.
Las manchas blancas /negras son técnicas para transferir las proteínas de la DNA y del RNA sobre un portador así que pueden ser separadas, y siguen a menudo el uso de un electrophoresis del gel. La mancha blanca /negra meridional se utiliza para transferir la DNA.
El hibridación de la punta de prueba a un fragmento específico de la DNA en la membrana del filtro indica que este fragmento contiene la secuencia de la DNA que es complementaria a la punta de prueba.
Las manchas blancas /negras meridionales se utilizan en varias áreas principales incluyendo descubrimiento y el asociar del gene, los estudios de la evolución y del desarrollo, diagnóstico y forensics.
Bajo condiciones óptimas, el borrar meridional detecta la paginación del ~ 0.1 de la DNA del interés
Para hacer 1 litro de almacenador intermediario de 20X SSC, agregue el siguiente:
¡Para los problemas y borrar meridional de localización de averías, fije una cuerda de rosca nueva para discutirla en el foro que borra meridional!
Guía De la Reproducción de la DNA
Electrophoresis Del Gel de la DNA
¡Digestión de la enzima de la restricción - todos lo que usted necesita saber!
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