Digestión de la enzima de la restricción

Enzimas de la restricción

Índice de la digestión de la restricción

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Estación molecular ©2006. Julio de 2008 actualizado.

¡Información sobre cómo hacer un experto en las enzimas de la restricción y la DNA del resumen!

Fondo en las enzimas de la restricción

Las enzimas de la restricción (o los endonucleases de la restricción) son las enzimas que cortan la DNA double-stranded haciendo dos roturas, una con cada uno de las espinas dorsales del fosfato de la hélice doble. La enzima hace esto sin el daño de las bases de la DNA. Aunque la enzima rompa la DNA, los vínculos químicos se pueden reformar por otras enzimas conocidas como ligasas de la DNA. Por lo tanto, los fragmentos de la restricción de la DNA de los diversos cromosomas o genes se pueden ligar juntos, proporcionando a sus extremos son complementarios.

Utilidad de las enzimas de la restricción en biología molecular

El hecho de que la DNA podría ser manipulada y diversos pedazos de la DNA se podrían ahora nunca empalmar juntos, los nuevos campos de investigación abiertos antes de imaginado. Muchos de los métodos en biología molecular confían hoy en las enzimas de la restricción. La “restricción” se deriva del hecho de que estas enzimas initally fueron descubiertas en Escherichia Coli que aparecía restringir la infección de los bacteriófagos específicos (“virus” de bacterias). Se cree que las enzimas de la restricción es un mecanismo de la defensa del huésped desarrollado por las bacterias y otros organismos para resistir infecciones virales, y para ayudar con la eliminación de secuencias virales.

En 1978, el Premio Nobel Para la medicina fue concedido a Werner Arber, a Daniel Nathans y a Hamilton Smith para su descubrimiento de los endonucleases de la restricción, que llevan al desarrollo de las tecnologías de DNA recombinantes. El primer uso práctico de las enzimas de la restricción en ciencia y medicina era la manipulación de las bacterias de Escherichia Coli para expresar la insulina humana recombinante para los diabéticos.

Manejando y con las enzimas de la restricción

Una unidad de actividad enzimática de la restricción es definida por la cantidad de enzima del restrition requerida para cortar 1 micrograma de DNA de la lambda del bacteriófago a la terminación en una época de 1 hora.

Los análisis se convirtieron por el fabricante de las enzimas son más probable hechos usando la DNA altamente purificada (es decir los plásmidos o DNA bacteriófaga de la lambda) como substrato, y el análisis condiciona que produce los mejores resultados con su preparación determinada. Las condiciones del laboratorio no están a menudo como ideal, y un exceso leve de enzima o de un período de incubación más largo se utiliza para ayudar a asegurar la digestión completa.

Hay muchos almacenadores intermediarios “universales” de la enzima que trabajarán con una variedad de enzimas, pero no cumplen a menudo los requisitos más eficientes para ninguna una enzima. Porque los almacenadores intermediarios universales no están como eficientes, no recomendamos su uso rutinario en el laboratorio (especialmente para DNAs genomic complejo; los resúmenes de DNAs genomic complejo están generalmente en las altas concentraciones de la DNA que inhibirán la enzima; también, las preparaciones relativamente crudas de la DNA pueden contener los inhibidores que requiere más tiempos más largos de la incubación del ard de la enzima de las unidades para la digestión completa). Es siempre el mejor utilizar las condiciones recomendadas del análisis del fabricante para la digestión del restricition. Algunos fabricantes han reproducido las enzimas que tienen requisitos muy diversos de otras versiones de la misma enzima, así que controlan antes de usar. Las concentraciones de la enzima se dan siempre en la cara del tubo de la enzima. Las enzimas de la restricción usadas en el laboratorio se salvan siempre en -20 grados C (en una base del glicerol), y se deben guardar tan cerca a -20 grados C como sea posible ampliar la vida de la enzima. Al fijar los resúmenes, traiga el tubo de la reacción al congelador de la enzima en un cubo de hielo; quite el tubo de la enzima del congelador y guarde el tubo en el hielo mientras que trabaja con la enzima. Vuelva inmediatamente el tubo al congelador cuando está acabado. Utilice el pipetmen señalado para las enzimas de la restricción solamente y utilice siempre una extremidad pipetman fresca al quitar la enzima del tubo común.

Extremidades en uso de la enzima de la restricción

• Todo el fabricante de enzimas de la restricción suministra almacenadores intermediarios específicos las enzimas, y éstos se deben salvar en el congelador de -20°C. Las enzimas de la restricción se deben también salvar en -20°C.
• Nunca componga los resúmenes de la restricción con la enzima de la restricción que compone más de 1/10 del volumen final. Esto es debido al hecho de que las proteínas enzimáticas de la restricción están salvadas en glicerol. En las concentraciones sobre el 10%, el glicerol no sólo inhibe la digestión pero también puede causar actividad de la estrella - llevando a los cortes aberrantes, no específicos de la DNA.
• Fije un resumen del control al usar las enzimas de la restricción. Esto le ayuda a saber si la enzima está trabajando correctamente y usted configura la reacción bien. Utilice una DNA del plásmido que genere modelos sabidos de la fragmentación.
• Al preparar los resúmenes dobles de la enzima, determine el contenido en sal de los almacenadores intermediarios. Conduzca la digestión de la restricción usando la enzima con los requisitos más bajos de la sal PRIMERO, después utilice la segunda enzima ajustando el almacenador intermediario del tubo de la reacción a la segunda concentración óptima de la sal.
• Las preparaciones de la DNA pueden tener impurezas que puedan inhibir actividad de la digestión de la enzima de la restricción. Algunos kits del aislamiento de la DNA incluso utilizan altos almacenadores intermediarios del EDTA para enjuagar la DNA. Esto es aceptable para el almacenaje de la DNA, pero las altas concentraciones de EDTA pueden inhibir la digestión de la restricción. La polimerización en cadena purifica su DNA y se enjuaga con TE o riega si su actividad enzimática se inhibe solamente sus miradas de la DNA OK. Usted podría también agregar Mg2+ a la reacción y ver si ese las ayudas también.
• Si usted no puede obtener la digestión completa de la restricción de su DNA después de agregar la enzima adicional, fije un nuevo resumen y agregue el spermidine a una concentración final de 2 milímetros.

Digestión de la enzima de la restricción de la DNA

Analítico contra digestiones preparatorias de la enzima de la restricción

Las digestiones de la DNA se conducen generalmente en UL 25 - 50 (microlitros), cuando usted apenas quiere controlar o analizar su DNA. Éstos se llaman las digestiones analíticas de la enzima de la restricción.

Uno puede digerir 0.25 a 2 ug (microgramas) para las preparaciones analíticas. Esto es porque en un minigel de la agarosa (30ml), uno puede visualizar aproximadamente .05ug (50 ng, nanograms) por venda. La visualización de una venda depende de la longitud de la DNA y de la cantidad de presente de la DNA. Generalmente cuanto más larga es la DNA presente en la venda, el más fácil es será ver.

Digestiones de la DNA de muchos microgramas y volúmenes más altos a partir del 50 - la UL 500 (microlitros) o más es preparatorios, significando que usted está preparando los fragmentos de la DNA para la purificación subsecuente y se está reproduciendo.

Digestión de la restricción del protocolo de la DNA

Receta para la digestión de la enzima de la restricción:

Analítico

Usted puede ser que agregue Mg2+ a la reacción de la digestión (bajo la forma de MgCl) si usted utiliza un de gran capacidad de la DNA. Usted debe hacer esto especialmente si el almacenador intermediario usted enjuagó su DNA en EDTA contenido. Esto es porque si “X” es grande, IE > 20ul el volumen, usted puede necesitar agregar el magnesio. El EDTA ata a 4 topos de magnesio para cada topo del EDTA. Así, la DNA en una solución (milimolar) de 1 milímetro del EDTA atará 4mM de magnesio. Una buena regla empírica es agregar 1 1ul de 10mM MgCl a cada 20ul de la DNA.

Preparatorio

Incube en 37°C por 1 - 3 horas.

1 unidad es bastante enzima a la DNA del ug digest1 por lo menos sobre 1 hora. Resumen por 3 horas usted podría digerir cantidades más altas de DNA. ¡Pues usted está agregando 10-20 unidades de enzima, usted podría incluso digerir 10ug de la DNA sobre 1 hora! ¡Las enzimas son costosas no las pierden innecesario!

Notas sobre uso de la enzima de la restricción:

• Mantenga las enzimas frías.
• ¡Guarde siempre las enzimas de la restricción en el hielo!
• Reduzca al mínimo el tiempo que usted tiene enzimas de la restricción en el hielo. Usted puede hacer esto fácilmente comprando un rectángulo frío (que sea básicamente un bloque del metal que usted guarda sus enzimas adentro)

Referencias:

Sambrook, J., Fritsch, E.F., y T. Maniatis. (1989) Reproducción molecular, un manual del laboratorio. Segunda edición. Prensa fría del laboratorio del puerto del resorte. pp 5.3 - 5.32.

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