Protocolo del aislamiento de la DNA de Genomic

Selección de un método de la purificación de la DNA de Genomic

La meta del aislamiento genomic de la DNA depende de lo que las aplicaciones de la DNA después del aislamiento. La pureza, la fuente, la cantidad y la calidad de la DNA son todas las ediciones que necesitan ser abordadas antes de la extracción genomic de la DNA. Un ordenador principal entero de diversos métodos, las tecnologías y los kits están disponibles ahora para los investigadores aislar la DNA genomic de las células.

Cantidad de DNA necesaria
Peso molecular y talla de la DNA
Pureza de la DNA requerida
Aplicaciones rio abajo de la DNA
Tiempo disponible
Facilidad de la técnica o del método de la extracción de la DNA
Costo o dinero disponible

Los métodos específicos de cosecha propia o del laboratorio de la DNA de la extracción para los laboratorios que los han desarrollado y utilizan a menudo absolutamente bien regularmente estos protocolos.

Observe sin embargo la estandardización de la carencia de estos métodos. También la producción de la DNA y la calidad de la DNA no son siempre reproductivas a partir de una persona al siguiente.

Fondo en el aislamiento y la purificación de la DNA de Genomic

Generalmente, todos los métodos implican la interrupción y la lisis de células. Esto es seguida a veces por el retiro del ARN (por RNAses, la sal u otros métodos). Eligiendo incluyendo qué método dependerá utilizar de muchos factores de la selección:

La DNA es aislada de las proteínas con varios métodos incluyendo la digestión de proteínas con las proteínas de la proteinasa K. de la enzima es quitada posteriormente salazón, la extracción orgánica, o atando de la DNA a una ayuda solid-phase (tal como una tecnología de la columna o de la silicona del intercambio aniónico).

La DNA finalmente es recuperada por la precipitación del etanol o la precipitación del isopropanol.

Generalmente la separación de DNA de las células y de los componentes celulares se puede dividir en cuatro etapas:

Interrupción de la célula
Lisis de la célula
Retiro de proteínas y de contaminantes
Recuperación de la DNA

En algunos protocolos genomic del aislamiento de la DNA, se combinan las etapas 1 y 2.

Materiales necesarios para el método de la extracción de la DNA de Genomic

Almacenador intermediario de la lisis para la receta de la DNA de Genomic:

Tris-Ácido clorhídrico de 50 milímetros, pH 8.0
EDTA 50mM
El 1% SDS
NaCl 10mM

Método de la purificación de la DNA de Genomic de muestras de tejido

Seleccione la muestra de tejido para utilizar. Cerciórese de que la muestra esté preparada y que guardada correctamente en el hielo. Si la muestra no es utilizada inmediatamente para la extracción de la DNA, después las muestras se deben salvar correctamente en el congelador de -20°C para de más largo plazo o 4°C para el uso a corto plazo (de pocas horas).
Corte el tejido en pedazos más pequeños. Para el hígado o el otro tejido suave, no se preocupe de hacer pedazos finos.
Agregue el tejido a un mortero prerefrigerado (del hielo seco), agregue inmediatamente el N2 del nitrógeno líquido.
Comience a moler el tejido en polvo fino. Agregue más Liq. N2 según lo necesitado. Transfiera el polvo frío al tubo de 30 ml, licencia destapada así que el N2 puede evaporarse.
Agregue 9 ml de por-calentado (5°C) el almacenador intermediario de la lisis y suspende de nuevo suavemente el polvo.
Agregue UL 100 de 10mg/ml de la proteinasa K, (es decir, 100 ug en la solución). Incube 55°C 1-18 horas. Mézclese suavemente periódicamente. Agregue UL 100 de la proteinasa K después de las primeras 2 horas, grado óptimo: 3 horas que agregan la proteinasa K en 1.5 horas.
Muestra del convite muy suavemente. Agregue 1 ml de 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml de caliente (55°C) el fenol, se mezcla suavemente pero a conciencia por 5-10 minutos.
Centrifugue las muestras por 15 minutos.
Relance la extracción caliente del fenol.
Extracto con el fenol igual del volumen (10ml): Cia (fenol de 1 porción: 1 porción Cia: CIA= 23 porciones de cloroformo: 1 porción de alcohol isoamílico)
Extracto con la extracción igual del volumen (10ml) Cia
La fase superior debe estar relativamente clara, si contiene golpes blancos grandes, o es muy lechosa, (i) incuba en 68°C 15 Min., y el extracto del re-fenol, (ii) comienzo otra vez, pero incuba más de largo con PK.
Fase superior de la transferencia al nuevo tubo. Agregue 2 volúmenes de etanol frío y mézclese suavemente (sal: Na0Ac está ya en la solución). Usando un gancho y un pasteur sellado mida con una pipeta la DNA del carrete hacia fuera. Limpie apagado exceso del etanol en la cara de los tubos. Suspenda de nuevo en 2-5 mls de TE. Cerciórese de que la DNA esté disuelta totalmente (licencia en la coctelera apacible.)
Agregue la mezcla de la ARNasa (100 ug de la ARNasa A, 10U de RNaseT1). Incube 30 37°C. mínimos ** usted podría agregar la ARNasa antes de la proteinasa K, incuba en 37°C para 1 hora y después comienza la digestión de la proteinasa. Usted podría entonces saltar el paso de progresión 15-.
Agregue 100 ug de la proteinasa K, incubae 37°C 30 minutos.
Agregue 1/10 vol. 3M Na0Ac, extracto del fenol una vez, fenol: Extracto de la Cia dos veces, extracto de la Cia una vez.
Agregue 2.5 volúmenes de EtOH, ponga en -20°C la centrifugadora de 30 Min. 20 Min.
Lávese bien con el 70%, quite todo el EtOH. Si usted se seca, no haga sobre SECO.
Suspenda de nuevo cuidadosamente, lentamente in1-2mls TE (almacenador intermediario del Tris-EDTA). (1x o 0.1x).