Interacciones De Prueba De la Proteína de la DNA

Aprenda sobre cómo probar interacciones de la DNA-PROTEI'NA.

Interacciones De Prueba De DNAProtein

Hay cuatro técnicas importantes para probar interacciones de la DNA-PROTEI'NA. Las primeras dos técnicas (atascamiento del filtro y rotación de la movilidad del gel) se determinan si su DNA está obrando recíprocamente con la proteína. Las otras dos técnicas (dNase Footprinting y DMS Footprinting) indican donde el sitio de la blanco de la interacción entre la proteína y la DNA miente en la DNA.

Atascamiento Del Filtro

Los filtros de la membrana de la nitrocelulosa se utilizan comúnmente para estirilizar con filtro soluciones por filtracio'n. Los filtros de la nitrocelulosa pueden atar la DNA, pero solamente bajo ciertas condiciones. La DNA de Singlestranded ata fácilmente a la nitrocelulosa, pero la DNA trenzada doble por sí mismo no . Por otra parte la proteína ata, y si una proteína está limitada a la DNA double-stranded el complejo protei'na-DNA atará. Refiera por favor al artículo obligatorio del análisis del filtro de la nitrocelulosa para más información.

Gelifiqúese La Rotación De la Movilidad

Para medir interacciones de la DNA-PROTEI'NA esta técnica confía en el hecho simple de que una DNA pequeña tiene una movilidad mucho más alta en electrophoresis del gel que lo hace la misma DNA cuando debe limitar a una proteína. Por lo tanto podemos etiquetar un fragmento trenzado doble de la DNA de la clase, después lo mezclamos con una proteína, y electrophorese el complejo. Entonces sujetamos el gel en autoradiografía para detectar la especie etiquetada. La talla pequeña de la DNA es importante en este análisis. Si un gene entero fuera utilizado su movilidad sería ya muy baja, y la rotación de la movilidad causada por el atascamiento de la proteína sería difícil de detectar. Por lo tanto debemos saber aproximadamente dónde la proteína ata a la DNA así que podemos preparar un fragmento corto de la restricción, o aún un oligonucleotide double-stranded sintetizado que contenga el sitio de la blanco para la proteína, pero poco .

DNase Footprinting

Una vez que sepamos que una proteína ata a una DNA dada podemos utilizar footprinting para descubrir dónde el sitio de la blanco miente en la DNA. El dnase footprinting confía en el hecho de que una proteína, atando a la DNA, cubre el sitio obligatorio y así que lo protege contra ataque de Dnase. En este sentido deja una "huella" en la DNA. El primer paso de progresión en un experimento footprinting es extremo-etiqueta la DNA. Podemos etiquetar cualquier hilo, pero solamente uno por el experimento. Después, atamos la proteína a la DNA. Entonces tratamos el complejo de la DNA-PROTEI'NA con el dnase I bajo condiciones suaves (dnase muy pequeño), de modo que un promedio de solamente uno cortado ocurra por la molécula de la DNA. Después, quitamos la proteína de la DNA, separamos los hilos de la DNA, y electrophorese los fragmentos que resultan en un polyacylamide de alta resolución se gelifican junto a etiquetas de plástico de la talla. Los fragmentos se presentarán del otro extremo de la DNA también, pero no los detectaremos porque están sin etiqueta. Incluimos siempre un control con la DNA sola (ninguna proteína), y utilizamos generalmente más de una concentración de la proteína así que podemos ver por la desaparición gradual de las vendas en la región de la huella que la protección de la DNA depende de la concentración de la proteína agregada. La huella representa la región de la DNA protegida por la proteína, y por lo tanto nos dice donde la proteína ata.

DMS Footprinting

El dnase footprinting da una buena idea de la localización del sitio obligatorio para la proteína, pero el dnase es una macromolécula y es por lo tanto un instrumento algo embotado para sondar los detalles finos del sitio obligatorio. Cuál significa, ése allí puede ser boquetes en la interacción entre la proteína y la DNA en la cual el dnase no cabría y por lo tanto no detectaría. Por otra parte, las proteínas obligatorias de la DNA perturban con frecuencia la DNA dentro de la región obligatoria, torciendo la hélice doble. Estas perturbaciones son interesantes, pero no son detectadas generalmente por Dnase footprinting porque la proteína mantiene el dnase ausente. Para hacer footprinting más detallado, necesitamos una molécula más pequeña que pueda caber en los nooks y los crannies de la DNA-PROTEI'NA compleja y revelamos más de las delicadezas de la interacción. Una herramienta preferida para este trabajo es el dimethylsulfate de desnaturalización del agente (DMS).

Con el DMS footprinting comenzamos de la misma manera que en el dnase footprinting, extremo-etiquetando la DNA y el atascamiento la proteína. Entonces desnaturalizamos el complejo de la DNA-PROTEI'NA con el DMS, usando un tratamiento suave de modo que en promedio solamente un methylation incluso ocurra por la molécula de la DNA. Después, desalojamos la proteína, y tratamos la DNA con un reactivo que quite los purines desnaturalizados, creando los sitios apurinic (deoxyriboses sin bases) en la DNA. Entonces rompemos la DNA en estos sitios apurinic. Estas reacciones son iguales que la DNA de Maxam-Gilbert que ordena reacciones. Finalmente electrophorese los fragmentos y autoradiograph de la DNA el gel para detectar la DNA etiquetada congregamos. Cada venda termina al lado de un nucleotide que fue desnaturalizado y así desprotegido por la proteína.

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