Interacciones de prueba de la proteína de la DNA

Aprenda sobre cómo probar interacciones de la DNA-proteína.

Interacciones de prueba de DNAProtein

Hay cuatro técnicas importantes para probar interacciones de la DNA-proteína. Las primeras dos técnicas (atascamiento del filtro y rotación de la movilidad del gel) determinan si su DNA está obrando recíprocamente con la proteína. Las otras dos técnicas (huella de la ADNasa y huella del DMS) indican donde el sitio de la blanco de la interacción entre la proteína y la DNA miente en la DNA.

Atascamiento del filtro

Los filtros de membrana de la nitrocelulosa son de uso general estirilizar con filtro soluciones por filtración. Los filtros de la nitrocelulosa pueden atar la DNA, pero solamente bajo ciertas condiciones. La DNA de una sola fila ata fácilmente a la nitrocelulosa, pero la DNA trenzada doble por sí mismo no hace. Por una parte la proteína ata, y si una proteína está limitada a la DNA double-stranded el complejo proteína-DNA atará. Refiera por favor al artículo obligatorio del análisis del filtro de la nitrocelulosa para más información.

Gelifiqúese la rotación de la movilidad

Para medir interacciones de la DNA-proteína esta técnica confía en el simple hecho de que una pequeña DNA tiene una movilidad mucho más alta en electroforesis del gel que lo hace la misma DNA cuando es limitar a una proteína. Por lo tanto podemos etiquetar un fragmento trenzado doble de la DNA de la clase, después lo mezclamos con una proteína, y electrophorese el complejo. Entonces sujetamos el gel en autoradiografía para detectar la especie etiquetada. El tamaño pequeño de la DNA es importante en este análisis. Si un gene entero fuera utilizado su movilidad sería ya muy baja, y la rotación de la movilidad causada por el atascamiento de la proteína sería difícil de detectar. Por lo tanto debemos saber aproximadamente dónde la proteína ata a la DNA así que podemos preparar un fragmento corto de la restricción, o aún un oligonucleótido double-stranded sintetizado que contenga el sitio de la blanco para la proteína, pero poco.

Huella de la ADNasa

Una vez que sabemos que una proteína ata a una DNA dada podemos utilizar el huella para descubrir dónde el sitio de la blanco miente en la DNA. El huella de la ADNasa confía en el hecho de que una proteína, atando a la DNA, cubre el punto de enlace y así que lo protege contra ataque de Dnase. En este sentido deja una “huella” en la DNA. El primer paso de progresión en un experimento del huella es fin-etiqueta la DNA. Podemos etiquetar cualquier hilo, pero solamente uno por el experimento. Después, atamos la proteína a la DNA. Entonces tratamos el complejo de la DNA-proteína con la ADNasa I bajo condiciones suaves (ADNasa muy pequeña), de modo que un promedio de solamente uno cortado ocurra por la molécula de la DNA. Después, quitamos la proteína de la DNA, separamos los hilos de la DNA, y electrophorese los fragmentos resultantes en un polyacylamide de alta resolución se gelifican junto a etiquetas de plástico de la talla. Los fragmentos se presentarán del otro extremo de la DNA también, pero no los detectaremos porque están sin etiqueta. Incluimos siempre un control con la DNA sola (ninguna proteína), y utilizamos generalmente más de una concentración de la proteína así que podemos ver por la desaparición gradual de las vendas en la región de la huella que la protección de la DNA depende de la concentración de la proteína agregada. La huella representa la región de DNA protegida por la proteína, y por lo tanto nos dice dónde la proteína ata.

Huella del DMS

El huella de la ADNasa da una buena idea de la localización del punto de enlace para la proteína, pero la ADNasa es una macromolécula y es por lo tanto un instrumento algo embotado para sondar los detalles finos del punto de enlace. Cuál significa, ése allí puede ser boquetes en la interacción entre la proteína y la DNA en la cual la ADNasa no cabría y por lo tanto no detectaría. Por otra parte, las proteínas obligatorias de la DNA perturban con frecuencia la DNA dentro de la región obligatoria, torciendo la hélice doble. Estas perturbaciones son interesantes, pero no son detectadas generalmente por el huella de Dnase porque la proteína mantiene la ADNasa ausente. Para hacer un huella más detallado, necesitamos una molécula más pequeña que pueda caber en los escondrijos y las grietas de la DNA-proteína compleja y revelamos más de las delicadezas de la interacción. Una herramienta preferida para este trabajo es el dimethylsulfate de desnaturalización del agente (DMS).

Con el huella del DMS comenzamos de la misma forma que en huella de la ADNasa, fin-etiquetando la DNA y el atascamiento la proteína. Entonces desnaturalizamos el complejo de la DNA-proteína con el DMS, usando un tratamiento suave de modo que en promedio solamente una metilación incluso ocurra por la molécula de la DNA. Después, desalojamos la proteína, y tratamos la DNA con un reactivo que quite las purinas desnaturalizadas, creando los sitios apurinic (deoxyriboses sin bases) en la DNA. Entonces rompemos la DNA en estos sitios apurinic. Estas reacciones son iguales que la DNA de Maxam-Gilbert que ordena reacciones. Finalmente electrophorese los fragmentos y autoradiograph de la DNA el gel para detectar la DNA etiquetada congregamos. Cada venda termina al lado de un nucleótido que fue desnaturalizado y así desprotegido por la proteína.

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