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El dNase footprinting es un método molecular de la biología que permite la detección de las interacciones de la DNA-PROTEI'NA explotando la característica que una proteína que obra recíprocamente con la DNA protegerá la DNA en ese sitio de la interacción contra la digestión de la restricción o la hendidura enzimática del dNAase. Un fragmento de la restricción de la DNA que contiene el sitio obligatorio específico se etiqueta en un extremo, generalmente con 32P y se utiliza para footprinting.
La proteína y la DNA se permiten cruzar por hibridacio'n y atar juntas.
La DNA footprinting utiliza el dNase I de la enzima o el aseácidoucleicI del nucle del eoxyribon de d para digerir o cortar lejos libremente (o etiquetado) la DNA radiactiva que sale la proteína de la DNA encuadernada protegida. Los fragmentos de la restricción de la DNA se tratan ligeramente con el dNase I, que hace las roturas del solo-hilo (mellas) en la DNA. Una cantidad pequeña de enzima se utiliza tales que hay un promedio de menos de 1 nick/strand. La reacción entonces se para, se desnaturaliza la DNA, y la mezcla se ejecuta en un polyacrylamide que desnaturaliza que ordena el gel. Estos fragmentos separados por electrophoresis del gel son expuestos para detectar el área protegida de la DNA analizando el modelo de la hendidura de las bandas en el gel.
El modelo de la hendidura de la DNA en ausencia de una proteína obligatoria de la DNA, designado típicamente la DNA libre, se compara al modelo de la hendidura de la DNA en la presencia de una proteína obligatoria de la DNA. Si la proteína ata la DNA, el sitio obligatorio se protege contra hendidura enzimática. Esta protección dará lugar a un área clara en el gel que se refiere como la "huella".
Variando la concentración de la proteína DNA-QUE ata, la afinidad obligatoria de la proteína se puede estimar según la concentración mínima de la proteína en la cual se observa una huella.
2X sin el kCl/para 10mls:
cantidad: [ final ]
Tris-HCl pH7.6: UL 500 del 1M: 50
milímetros
MgCl2: 125ul del 1M: el 12.5mM
EDTA: UL 2 de los 0.5M: el 1mM
Glicerol: 2 mls: el 20%
DTT: UL 10 del 1M: 1 milímetro
5X sin el KCL
[ final ]: ingrediente
el 20%: gylerol
los 5mM: MgCl2
los 2.5mM: EDTA
los 2.5mM: DTT
los 250mM: NaCl
los 50mM: Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml: (dI-C.C.) poly poly (dI-C.C.)
Para 10mls
CaCl2: UL 50 del 1M: 5 milímetros
MgCl2: UL 100 del 1M: 10 milímetros
Solución Del Cargamento
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v)
0.1%: cyanol del xileno
0.1%: azul del bromophenol
Pare El Almacenador intermediario
10mls
NaCl: UL 400 de los 5M: 200 milímetros
EDTA: UL 600 de los 0.5M: 30 milímetros
Sds: 1 ml el 10%: el 1%
TEBe (mercap Tris-EDTA-Beta.)
Tris-HCl, pH 7.6: UL 500 de 1 M: 50 milímetros
EDTA: 2ul de 0.5 M: 1 milímetro
Beta-beta-mercaptoethanol: UL 10: el 15mM
almacenador intermediario de 10 x K
para 1 ml
Tris-HCl pH 7.5: UL 100 de 1 M: 100
milímetros
MgCl2: UL 100 de 1 M: el 100mM
DTT: UL 50 del 1M: 50 milímetros
dH2O: UL 750
La DNA usada contiene generalmente el sitio obligatorio de su proteína del interés. La DNA se purifica, después se digiere con los fragmentos de la restricción para estar de una talla del appopriate. El fragmento de la DNA se etiqueta en un extremo (sitio obligatorio > el punto de ebullición 25 del extremo).
Un etiquetado del hilo puede ser accomplised cerca:
Para los fragmentos de Klenow, 0.3ug traen UL hasta 100 en TE, matanza Klenow del calor en el °C 68 por 10 minutos.
Muestra RXN: 15 ng son necesidad de cada
reacción. Si hace la punta de prueba para la cantidad JUSTA del
aumento de muchas reacciones de DNA hasta 300 ngs.
15ng: Fragmento de la DNA
UL 2: almacenador intermediario de 10x K
UL 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
UL 2: dA de los 2mM @, dTTP del dG
1 UL: Klenow
20 volúmenes finales de la UL, 37°C 30 minutos.
-- agregue 1 dNTP de la UL el 10mM, 5 minutos @ 37°C.
-- agregue 80 UL TE. 68°C 15 minutos, puso encendido
el hielo.
-- columna de la vuelta G-50 (vuelta en alrededor 2000g)
-- agregue 1/10 vol. los 3M Na0Ac, 2.5 volúmenes de
EtOH, hielan 30 minutos, (de opcional si [ DNA ] = o es > 3 ng/ul
usted puede ser que fije G-50 directamente) Microfuge 30 minutos.
-- colada con el 70%
-- seco traiga para arriba en 5ul
La reacción obligatoria debe tener entre el kCl
de 10 y del 150mM (más sal reduce el atar pero especificidad de los
aumentos). La concentración típica es los 50mM.
Atascamiento de la DNA De la Proteína:
UL 25 del almacenador intermediario obligatorio 2X sin el
kCl
5ul de 3 ng/ul unilabeled la DNA
UL X del kCl para igualar 10-150 milímetros de kCl
dH20 a la UL del igual 50 menos el volumen para el
atascamiento protien
1-3 unidades de Footprinting de la proteína
obligatoria de la DNA (o 10 a 160 ug del extracto nuclear crudo)
-- la mezcla suavemente, hiela 10 minutos.
SINCRONIZACIÓN DEL MANTIENE EN MENTE,
-- agregue UL 50 de la solución del RT Ca/Mg, 18°C
para 1 minuto.
-- agregue UL 3 que el dNase diluído RQ1 (0.05 u/ul diluido en
Tris) INCUBA 1 minuto.
-- pare la adición de 90 con las soluciones de la PARADA 37°C,
-- usted si el fenol: Extracto de la Cia, y
de la Cia, y precipitado del etanol.
-- suspenda de nuevo en 4ul de la solución del cargamento.
-- ejecútese en Urea-DNA estándar del 5% que ordena el gel
(considere el gel de la cuña) con los carriles del cargamento del
appopriate tales como escala de la DNA, DNA sin cortar, y controles.
Analice el modelo footprinting.
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