Huella de la DNA

Fondo en huella de la DNA

El huella de la ADNasa es un método de la biología molecular que permite la detección de interacciones de la DNA-proteína explotando la característica que una proteína que obra recíprocamente con la DNA protegerá la DNA en ese sitio de la interacción contra la digestión de la restricción o la hendidura enzimática de la ADNasa. Un fragmento de la restricción de la DNA que contiene el punto de enlace específico se etiqueta en un extremo, generalmente con 32P y se utiliza para el huella.

La proteína y la DNA se permiten cruzar por hibridación y vincular.

El huella de la DNA utiliza la ADNasa I de la enzima o la nucleasa I del ácido desoxirribonucléico para digerir o cortar libremente (o etiquetado) la DNA radiactiva que sale la proteína de la DNA encuadernada protegida. Los fragmentos de la restricción de la DNA se tratan ligeramente con la ADNasa I, que hace las roturas de una sola fila (mellas) en la DNA. Una pequeña cantidad de enzima se utiliza tales que hay un promedio de menos de 1 mella/hilo. La reacción entonces se para, se desnaturaliza la DNA, y la mezcla se ejecuta en una poliacrilamida de desnaturalización que ordena el gel. Estos fragmentos se separaron por electroforesis del gel son expuestos para detectar el área protegida de la DNA analizando el modelo de la hendidura de las bandas en el gel.

El modelo de la hendidura de la DNA en la ausencia de una proteína obligatoria de la DNA, designada típicamente la DNA libre, se compara al modelo de la hendidura de la DNA en presencia de una proteína obligatoria de la DNA. Si la proteína ata la DNA, el punto de enlace se protege contra hendidura enzimática. Esta protección dará lugar a un área clara en el gel que se refiere como la “huella”.

Variando la concentración de la proteína DNA-obligatoria, la afinidad obligatoria de la proteína se puede estimar según la concentración mínima de proteína en la cual se observa una huella.

Recetas del almacenador intermediario del huella de la ADNasa

Receta obligatoria del almacenador intermediario del huella de la ADNasa

2X sin el KCl/para 10mls:

cantidad: [final]
Tris-Ácido clorhídrico pH7.6: UL 500 de el 1M: 50 milímetros
MgCl2: 125ul de el 1M: 12.5mM
EDTA: UL 2 de los 0.5M: 1mM
Glicerol: 2 mls: el 20%
DTT: UL 10 de el 1M: 1 milímetro

Almacenador intermediario obligatorio (almacenador intermediario de la rotación del gel)

5X sin el KCL
[final]: ingrediente
el 20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-ÁCIDO CLORHÍDRICO, pH 7.5
0.25mg/ml: (dI-C.C.) polivinílico polivinílico (dI-C.C.)

Almacenador intermediario de Ca/Mg

Para 10mls
CaCl2: UL 50 de el 1M: 5 milímetros
MgCl2: UL 100 de el 1M: 10 milímetros

Solución del cargamento
0.1 M: NaOH: formamid (1: 2 v/v)
0.1%: cyanol del xileno
0.1%: azul del bromofenol

Pare el almacenador intermediario
10mls
NaCl: UL 400 de los 5M: 200 milímetros
EDTA: UL 600 de los 0.5M: 30 milímetros
SDS: 1 10%:1% del ml

TEBe (mercap Tris-EDTA-Beta.)
Tris-Ácido clorhídrico, UL del 7.6:500 del pH de 1 M: 50 milímetros
EDTA: 2ul de 0.5 M: 1 milímetro
Beta-mercaptoetanol: UL 10: 15mM

almacenador intermediario de 10 x K
para 1 ml
UL del 7.5:100 de Tris-Ácido clorhídrico pH de 1 M: 100 milímetros
MgCl2: UL 100 de 1 M: 100mM
DTT: UL 50 de el 1M: 50 milímetros
dH2O: UL 750

Protocolo del huella de la ADNasa

La DNA usada contiene generalmente el punto de enlace de su proteína del interés. La DNA se purifica, después se digiere con los fragmentos de la restricción para estar de una talla del appopriate. El fragmento de la DNA se etiqueta en un extremo (punto de enlace > el punto de ebullición 25 del extremo).

Un etiquetado del hilo se puede accomplised cerca:

aislando el fragmento con las enzimas de la restricción que contienen ' proyección 5, etiquetando con Klenow y el nucleótido caliente apropiado. Entonces resumen con una enzima que quita un extremo.
el aislamiento de un fragmento digerido con una enzima de la restricción que cree 5 ' y proyección los 3 ' termine, etiquetando con Klenow etiquetará solamente 5 la '.
Como en “a” pero con cualquie enzima y usar la cinasa de polinucleótido para etiquetar ' extremo 3 (cinasa) y el resumen de uno de los extremos con una segunda (tercera) enzima de la restricción.
(RECORDATORIO: si etiqueta con Klenow, en el final de la reacción agregue un exceso de nucleótido frío del mismo nucleótido se completa que se etiqueta (es decir si usted utiliza dCTP32, agregue el dCTP en el extremo) para cerciorarse de todos los extremos igualmente.

Para los fragmentos de Klenow, 0.3ug traen UL hasta 100 en TE, matanza Klenow del calor en el °C 68 por 10 minutos.

ETIQUETADO con ' proyección un 5

Muestra RXN: 15 ng son necesidad de cada reacción. Si hace la punta de prueba para muchas reacciones APENAS aumente la cantidad de DNA hasta 300 ngs.
15ng: Fragmento de la DNA
UL 2: almacenador intermediario de 10x K
UL 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
UL 2: 2mM @ DA, dTTP del dG
1 UL: Klenow
20 volúmenes finales de la UL, 37°C 30 Min.
--agregue 1 dNTP de la UL 10mM, 5 minuto @ 37°C.

--agregue 80 UL TE. 68°C 15 minutos, puso el hielo.
--Columna de la vuelta G-50 (vuelta aproximadamente 2000g)
--AGREGUE 1/10 vol. 3M Na0Ac, 2.5 volúmenes de EtOH, hiele 30 minutos, (de opcional si [DNA] = o es > 3 ng/ul usted puede ser que fije G-50 directamente) Microfuge 30 minutos.
--lávese con el 70%
--Seco traiga para arriba en 5ul

Reacción obligatoria para el huella de la ADNasa

La reacción obligatoria debe tener entre el KCl de 10 y 150mM (más sal reduce el atar pero especificidad de los aumentos). La concentración típica es 50mM.

Atascamiento de la DNA de la proteína:
UL 25 del almacenador intermediario obligatorio 2X sin el KCl
5ul de la DNA unilabeled 3 ng/ul
UL X del KCl para igualar 10-150 milímetros de KCl
dH20 para igualar UL 50 menos el volumen para atar protien
1-3 unidades del huella de proteína obligatoria de la DNA (o 10 a 160 ug del extracto nuclear crudo)

--la mezcla suavemente, hiela 10 minutos.

SINCRONIZACIÓN DEL MANTIENE EN MENTE,
--AGREGUE UL 50 de la solución del RT Ca/Mg, 18°C para 1 minuto.
--AGREGUE UL 3 que la ADNasa diluída RQ1 (0.05 u/ul diluidos en Tris) INCUBA 1 minuto.
--PARE la adición de 90 con las soluciones de la PARADA 37°C,

--usted debe fenol: Extracto de la Cia, y de la Cia, y precipitado del etanol.
--SUSPENDA DE NUEVO en 4ul de la solución del cargamento.
--Ejecútese en Urea-DNA estándar del 5% que ordena el gel (considere el gel de la cuña) con los carriles del cargamento del appopriate tales como escala de la DNA, DNA sin cortar, y controles.

Analice el modelo del huella.

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