Bioinformatics, Protocolos, Proteína Proteomics del RNA de la DNA
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Aprenda sobre la reproducción de la DNA.
Una DNA (corta para la DNA complemantary o la DNA de la copia) es una copia de la DNA de un RNA, generalmente un mRNA. Deseamos a veces hacer una biblioteca de la DNA, un conjunto de reproducimos reprensenting tanto como sea posible de los mRNAs en un tipo dado de la célula en un momento dado. Tales bibliotecas pueden contener diez de millares de diferente se reproducen. Otras veces, deseamos hacer un aclone determinado de la DNA que contiene una copia de la DNA de apenas un mRNA. Esta técnica que utilizamos depende en la parte en la cual de estas metas deseamos alcanzar.
Si deseamos construir una biblioteca de la DNA,
podemos utilizar una estrategia simple pero eficaz que confíe en una
traducción llamada de proceso de la mella. La esencia de la
traducción de la mella es el retiro simultáneo de la DNA delante de
una mella (una rotura solo-trenzada de la DNA) y de la síntesis de la
DNA detrás de la mella. El beneficio neto es moverse, o
traduzca la mella en la ' dirección el 5'-3. La enzima que
utilizamos generalmente la traducción de la mella es la polimerasa I
de la DNA de E.coli, que tiene la ' actividad del exonuclease un 5'-3
que permite que la enzima degrade la DNA delante de la mella mientras
que se mueve adelante.
La parte central cualquier procedimiento de la
reproducción de la DNA es síntesis de la DNA de un modelo del mRNA
usando transcriptase reverso. El transcriptase reverso es como
cualquier otra enzima de DNA-SINTETIZACIO'N es que no puede iniciar
síntesis de la DNA sin una cartilla. Para conseguir alrededor
de este problema, nos aprovechamos de la cola del poly(A) en los
3'-extremos de la mayoría de los mRNAs eukaryotic y utilizamos el
oligo(dT) como la cartilla. El oligo(dT) es complementario al
poly(A), así que ata al poly(A) en los 3'-extremos del mRNA y prepara
síntesis de la DNA, usando el mRNA como modelo.
Después de que el mRNA se haya copiado, rindiendo una DNA
solo-trenzada (el "primer hilo"), degradamos parcialmente el mRNA con
el ribonuclease H (rNase H). Esta enzima degrada el hilo del RNA
de un híbrido de RNA/DNA apenas qué necesitamos para comenzar a
digerir el RNA de nuestra primera DNA del hilo. Los fragmentos
restantes del RNA sirven como las cartillas para hacer el "segundo
hilo," con el primer como el modelo. Ésta es la fase de la
mella-traduccio'n del proceso y otra vez, la polimerasa I de la DNA
del E. coli es la enzima que utilizamos realizar la reacción de la
mella-traduccio'n. El beneficio neto es una DNA double-stranded
con un fragmento pequeño del RNA en los 5'-extremos del segundo hilo.
Nuestra tarea siguiente es ligar la DNA a un vector. Esto
era fácil con nuestros pedazos de DNA genomic hendidos con las
enzimas de la restricción, pero DNAS no tienen ningún extremo
pegajoso. Podemos ligar extremos embotados juntos, aunque eso es
un proceso relativamente ineficaz. Sin embargo, si deseamos la
ligadura eficiente producida por los extremos pegajosos, podemos
clavar los extremos con tachuelas pegajosos (oligo[dC ]) sobre la DNA,
usando una enzima llamada transferase terminal del deoxynucleotidyl
(TdT) o transferase simplemente terminal y uno de los trifosfatos del
deoxribonucleoside. En el caso, utilizamos dCTP. La enzima
agrega dCMPs, uno a la vez, al 3'-ends de la DNA. De la misma
manera, asociamos extremos del oligo(dG) a nuestro vector y permitimos
el oligo (dC)s a destemplar a los oligo(dG)s. Esto trae el
vector y la DNA junta en una DNA recombinant que se pueda utilizar
directamente para la transformación. El emparejar bajo entre
las colas del oligonucleotide es bastante fuerte que no se requiere
ninguna ligadura antes de la transformación. El ligase de la
DNA dentro de las células transformadas finalmente realiza la
ligadura.
Vea la molécula de la DNA en 3-Dimensions
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