Bioinformatics, Protocolos, Proteína Proteomics del RNA de la DNA
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| Cuerdas de rosca | |||
| Título/Cartel De la Cuerda de rosca | Poste Pasado | Contestaciones | Opiniónes |
| 03-24-2008 02:03 P.M. | 1 | 355 | |
| 02-20-2008 08:45 | 1 | 588 | |
| 01-23-2008 04:17
por
el postdock " | 2 | 453 | |
| 05-16-2007 06:30 P.M. | 0 | 897 | |
| 12-31-1969 11:00 P.M.
por
" | 0 | 82 | |
| 03-28-2008 10:58
por
serenacorallini " | 3 | 505 | |
| 07-19-2007 04:53
por
el aftabac " | 0 | 534 | |
| 06-04-2008 12:46 | 5 | 92 | |
| 11-12-2007 07:44 P.M.
por
el bsengez " | 4 | 554 | |
| 01-24-2008 03:27 P.M.
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el princezz " | 2 | 254 | |
| 09-17-2007 04:16 P.M. | 1 | 302 | |
| 12-05-2006 09:49 P.M. | 2 | 1284 | |
| 01-24-2008 10:15 P.M.
por
el shurgood " | 0 | 370 | |
¡Ahora fije una pregunta en el foro de la
reproducción de la DNA! Consiga la ayuda haciendo clic aquí Para reproducirle necesite el siguiente:
La DNA del vector puede ser:
DNA del vector o del plasmid (que necesita ser
Para reproducirle necesite por lo menos varios microgramos (3-5 o más) de su DNA del vector.
La DNA del separador de millares puede ser:
Separador de millares del oligonucleotide (oligos con
los mitad-sitios del corte de la restricción destemplados y
phosphorylated con PNK)
Separador de millares Generado Enzima De la
Restricción
Separador de millares de PCR (PCR con los
sitios del corte de la enzima de la restricción (el sitio entero es
necesario!) en el extremo’ 5 de la cartilla)
Si el separador de millares que usted desea reproducirse es menos de 60 el punto de ebullición, usted puede pedir los oligonucleotides y destemplarlos juntos.
Si su talla de la DNA del separador de millares es pequeña (menos el punto de ebullición de 1000), usted no necesita teóricamente tanta DNA como su vector. Si su talla de la DNA del separador de millares es minúscula (el punto de ebullición 10-200), usted necesita muy poco de esta DNA teóricamente.
En general usted debe tener por lo menos 1 microgramo de comenzar la DNA del separador de millares.
Encontramos que la manera más fácil de preparar la DNA está utilizando un kit mini-preparacio'n (Qiagen). Utilizamos varias columnas para la misma construcción de la DNA del vector.
Para cada columna agregamos cerca de 4 ml de bacterias crecidas libra (agregamos 2 ml de caldo de las bacterias de la libra a un tubo del eppendorf de 2 ml y hacemos girar dos veces = 2 x 2 ml = 4 ml)
Extremidad: Crezca siempre cerca de 5 ml de libra en tubos del halcón de 15 ml, guardan el 1 ml como las bacterias de un glicerol almacenan congelado en – el congelador de 80 C.
¡Cómo hacer un glicerol la acción bacteriana para – el congelador de 80 C que guardará por los años (usted nunca tendrá que rayar las placas o hacer las células competentes otra vez! – le salva tiempo)
Agregue simplemente el glicerol del 50% a su crecimiento bacteriano libra. Éste no tiene que ser IE exacto si le dejan con cerca de 1 ml de libra bacteriana agrega cerca de 500 uL del glicerol 100% y congela en – los 80 C.
Después de enjuagar cada columna con cerca de 50 uL del EB (el almacenador intermediario del elution, Qiagen, almacenador intermediario de Tris – no contiene el EDTA), reunimos los eluates tales que tenemos alrededor 200 uL a 400 uL (o 4 – 8 columnas por la construcción o el vector). Esto es da bastante DNA del vector que comienza para la reproducción.
Nota: encontramos que el EDTA en TE inhibe la digestión subsecuente de la restricción de la DNA enjuagada de mini-preparacio'n y de otros kits de la purificación del plasmid.
Inserte la DNA debe ser
El vector del plasmid se corta generalmente.
Para ligar el separador de millares para vector, utilice 200 ng del vector como guía (la gente utiliza tan poco como 50 el manual – del ng N.E.B).
Inserte ng = ng del vector
Inserte la talla del vector de la
talla
Por lo tanto para ligar un separador de millares de 500 puntos de ebullición en un vector de 5000 puntos de ebullición que usted necesitaría
Inserte ng = 200 ng X 500
5000
Inserte ng = 20 ng del separador de millares necesitados para un 1: 1 ligadura
Para un separador de millares 3: 1 ligadura del vector que usted necesitaría: 60 ng
Ligadura
Vector de la DNA de los uL X 200
ng
Separador de millares de los uL de Y (ng
calculado)
2 almacenador intermediario de los uL 10 X
1 ligase NEB de la DNA de los uL T4
a 20 uL H20
total de 20 uL
Tome 5 uL de la ligadura y agregue a 100 uL de
las células Invitrogen de la alfa del ADO 5
(autorización de la eficacia de Subcloning, una tirada
mejor, eficacia lo más mejor posible para – las ligaduras
duras pero costoso máximos).
Caliente El Choque
Agregue 250 uL del SOC a las células competentes
Platee la cantidad ENTERA en la placa.
Crezca el overnite en 37 C
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