Reproducción de la DNA

Separadores de millares de clonación en plásmidos

Protocolo de la reproducción de la DNA

Para reproducirle necesite el siguiente:

Vector la DNA o su construcción del plásmido

La DNA del vector puede ser:
DNA del vector o del plásmido (que necesita ser

Para reproducirle necesite por lo menos varios microgramas (3-5 o más) de su DNA del vector.

Inserte la DNA (DNA que usted quiere insertar en el plásmido o el vector)

La DNA del separador de millares puede ser:
Separador de millares del oligonucleótido (oligos con los mitad-sitios del corte de la restricción destemplados y phosphorylated con PNK)
Separador de millares generado enzima de la restricción
La polimerización en cadena inserta (polimerización en cadena con los sitios del corte de la enzima de la restricción (el sitio entero es necesario!) en ' extremo los 5 de la cartilla)

Si el separador de millares que usted quiere reproducirse es menos de 60 el punto de ebullición, usted puede pedir los oligonucleótidos y destemplarlos juntos.

Si su talla de la DNA del separador de millares es pequeña (menos el punto de ebullición de 1000), usted no necesita teóricamente tanta DNA como su vector. Si su talla de la DNA del separador de millares es minúscula (el punto de ebullición 10-200), usted necesita muy poco de esta DNA teóricamente.

En general usted debe tener por lo menos 1 micrograma de comenzar la DNA del separador de millares.

Preparación de la DNA del vector para la reproducción: Mini-prepare, Midi-prepare, Maxi-prepare

Encontramos que la manera más fácil de preparar la DNA es el usar mini-prepara el kit (Qiagen). Utilizamos varias columnas para la misma construcción de la DNA del vector. 

Para cada columna agregamos cerca de 4 ml de bacterias crecidas libra (agregamos 2 ml de caldo de las bacterias de la libra a un tubo del eppendorf de 2 ml y hacemos girar dos veces = 2 x 2 ml = 4 ml)

Extremidad: Crezca siempre cerca de 5 ml de libra en tubos del halcón de 15 ml, guardan el 1 ml como las bacterias de un glicerol almacenan congelado en - congelador de 80 C.

¡Cómo hacer un glicerol la acción bacteriana para - el congelador de 80 C que guardará por los años (usted nunca tendrá que rayar las placas o hacer las células competentes otra vez! - le salva tiempo)

Agregue simplemente el glicerol del 50% a su crecimiento bacteriano libra. Éste no tiene que ser IE exacto si le dejan con cerca de 1 ml de libra bacteriana agrega UL cerca de 500 del glicerol 100% y congela en - 80 C.

Después de enjuagar cada columna con UL cerca de 50 de EB (almacenador intermediario de la elución, Qiagen, almacenador intermediario de Tris - no contiene el EDTA), reunimos los eluídos tales que tenemos UL alrededor 200 a UL 400 (o 4 - 8 columnas por la construcción o el vector). Esto es da bastante DNA del vector que comienza para la reproducción.

Nota: encontramos que el EDTA en TE inhibe la digestión subsecuente de la restricción de la DNA enjuagada de mini-prepara y otros kits de la purificación del plásmido.

Preparación de la DNA del separador de millares para la reproducción

Inserte la DNA debe ser

Digestión y corte de la enzima de la restricción su vector del plásmido para la reproducción de la DNA

El vector del plásmido se corta generalmente.

Ligadura del separador de millares y del vector

Para ligar el separador de millares para vector, utilice 200 ng del vector como guía (la gente utiliza tan poco como 50 ng - manual de N.E.B).

Inserte el ng      =       Ng del vector               
Inserte la talla            Vector la talla

Por lo tanto para ligar un separador de millares de 500 puntos de ebullición en un vector de 5000 puntos de ebullición que usted necesitaría

Inserte el ng      =       200 ng X   500                         
                             5000

Inserte el ng      =      20 ng del separador de millares necesitaron para un 1: 1 ligadura

Para un separador de millares 3:  1 ligadura del vector que usted necesitaría: 60 ng