Transfección de la célula

La transfección describe la introducción de material no nativo en las células eucarióticas usando un vector del virus u otros medios de la transferencia.

La transfección del término para los métodos no-virales es la más de uso frecuente de referencia a las células mamíferas, mientras que la transformación del término se prefiere para describir transferencia no-viral de la DNA en bacterias y células eucarióticas no animales tales como hongos, algas y plantas.

La transfección de las células animales implica típicamente el abrir de poros o de los “agujeros transitorios” en la membrana de plasma de la célula, para permitir la absorción del material. El material genético (tal como construcciones supercoiled de la DNA o del siRNA del plásmido), o aún las proteínas tales como anticuerpos, puede transfected. Además de la electroporación, la transfección puede ser realizada mezclando un lípido catiónico con el material para producir los liposomas, que se funden con la membrana de plasma de la célula y depositan su cargo adentro.

El significado original de la transfección era “infección por la transformación”, es decir introducción de DNA (o de ARN) de un virus o de un bacteriófago del eucariota en las células, dando por resultado una infección. Porque la transformación del término tenía otro sentido en la biología de célula animal (un cambio genético permitiendo la propagación de largo plazo en cultura, o la adquisición de las características típicas de células cancerosas), la transfección del término adquirió, para las células animales, su actual significado de un cambio en las características de la célula causadas por la introducción de la DNA.

La transfección es un método por el cual la DNA experimental se puede poner en una célula mamífera cultivada. Tales experimentos se realizan generalmente usando la DNA reproducida que contiene las secuencias de codificación y las regiones de control (promotores, etc) para probar si la DNA será expresada. Puesto que la DNA reproducida se pudo haber modificado extensivamente (por ejemplo, los puntos de enlace de la proteína en el promotor pudieron haber sido alterados o haber sido quitados), la transfección es de uso frecuente probar si una modificación determinada afecta a la función de un gene.

Diagrama de la transfección:

Aplicaciones de la transfección

La capacidad de sintetizar el ARN en el laboratorio es crítica a muchas técnicas. Las puntas de prueba radiactivas y no-radiactivas del ARN se requieren para muchos protocolos, y pueden ser sintetizadas fácilmente en reacciones ines vitro de la transcripción de la pequeña escala permitiendo su uso en hibridaciones de la mancha blanca /negra y análisis de la protección de la nucleasa.

• Vector o DNA
• Células
• Reactivo de la transfección

La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleótido, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio

La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleótido, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio

Métodos de la transfección

Hay varios métodos de introducir la DNA no nativa en una célula eucariótica. Muchos materiales se han utilizado como portadores para la transfección, que se puede dividir en tres clases: polímeros, liposomas y nanoparticles (catiónicos).

Uno (y menos confiables) de los métodos más baratos es transfección al lado del fosfato de calcio, descubierto originalmente por F.L. Graham y A.J. van der Eb en 1973 [citación necesaria] (véase también [1]). la solución salina HEPES-protegida (HeBS) que contiene los iones del fosfato se combina con una solución del cloruro de calcio que contiene la DNA que transfected. Cuando se combinan los dos, un precipitado fino - calcio cargado y negativamente - del fosfato cargado formará positivamente, atando la DNA que transfected en su superficie. La suspensión del precipitado entonces se agrega a las células que transfected (generalmente un cultivo celular crecido en una capa monomolecular). Por un proceso entendido no enteramente, las células toman alguno del precipitado, y con él, la DNA.

Otros métodos utilizan los compuestos orgánicos de muchas ramas, dendrimers supuestos, para atar la DNA y para conseguirla en la célula. Un método muy eficiente es la inclusión de la DNA que transfected en los liposomas, es decir los cuerpos pequeños, membrana-limitados que son en cierto modo similares a la estructura de una célula y pueden fundirse realmente con la membrana celular, release/versión la DNA en la célula. Para las células eucarióticas, el lípido-catión basado transfección se utiliza más típicamente, porque las células son más sensibles.

Otro método es el uso de polímeros catiónicos tales como DEAE-dextrano o polyethylenimine. Negativamente - la DNA cargada ata al polycation y el complejo es tomado por la célula vía endocytosis.

Un acercamiento directo a la transfección es el arma del gene, donde la DNA se junta a un nanoparticle de un sólido inerte (comúnmente oro) que entonces “se tire” directamente en el núcleo de célula de blanco. La DNA se puede también introducir en las células usando virus como portador. En tales casos, la técnica se llama transducción viral, y, las células reputan transduced.

Otros métodos de transfección incluyen el nucleofection, electroporación, choque del calor, magnetofection y los reactivo propietarios de la transfección tales como Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene o DreamFect.

Establo contra métodos transitorios de la transfección

Para la mayoría de las aplicaciones de la transfección, es suficiente si el gene transfected se expresa solamente transitorio. Puesto que la DNA introducida en el proceso de la transfección no se inserta generalmente en el genoma nuclear, la DNA no nativa se pierde en el estado avanzado cuando las células experimentan la mitosis. Si se desea que el gene transfected permanece realmente en el genoma de la célula y de sus células de hija, una transfección estable debe ocurrir.

Para lograr esto, otro gene es el co-transfected, que da a célula una cierta ventaja de la selección, tal como resistencia hacia cierta toxina. Algunas (muy pocos) de las células transfected, habrán insertado por casualidad el material genético no nativo en su genoma. Si la toxina, hacia la cual el gene co-transfected ofrece resistencia, entonces se agrega al cultivo celular, sólo esas pocas células con los genes no nativos insertados en su genoma podrán proliferar, mientras que morirán otras células. Después de aplicar esta presión de la selección por algún tiempo, solamente sigue habiendo y se puede cultivar las células con una transfección estable más lejos.

Un agente común para la transfección estable es Geneticin, también conocido como G418, que es una toxina que se puede neutralizar por el producto del gene resistente de la neomicina.

La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleótido, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio

Extremidades para la transfección

• ¡Utilice los inhibidores de la ARNasa siempre!
• Dinero del ahorro con la polimerasa bacteriófaga del ARN T7: Las copias con una etiqueta de la N-terminal His-6 están disponibles. Si usted obtiene esta copia, usted puede purificar granes cantidades de la polimerasa T7 con la alta actividad (referencia: Él B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Díaz G, Castagna R, PESO de McAllister, Durbin RK. Proteína Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Para quitar el modelo de la DNA, utilice una ADNasa ARNasa-libre. Hemos utilizado la ADNasa RQ1 (Promega) agregada por 15 minutos y trabaja bien. 

Salvar el reactivo de Trasfection

• El ARN se salva mejor en un pH neutral con EDTA.
• Se recomienda el almacenador intermediario de TE (EDTA de Tris-Ácido clorhídrico, del pH 7.5, de 1 milímetro de 10 milímetros), no obstante esto se debe preparar con la ARNasa purificada libremente (preferablly agua del Millipore).

Problemas de la transfección de la localización de averías

Transfecciones falladas

• Reactivo viejo de la transfección
• Agente incorrectamente salvado de la transfección
• DNA de la mal calidad o vector
• Cantidad escasa de la DNA
• Reactivo escaso de la transfección
• Demasiada DNA
• Demasiado reactivo de la transfección

Referencias en la transfección

Referencias en la transfección

1. Bacchetti S, Graham F (1977). “Transferencia del gene para la cinasa de la timidina a las células humanas cinasa-deficientes de la timidina por la DNA viral purificada del simplex de herpes”. Proc Acad nacional Sci los E.E.U.U. 74 (4): 1590-4. PMID 193108.