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Este sitio de Transfection es su portal para todas las cosas relacionadas con el transfection de células con el plasmid o el vector de la DNA, del RNA si siRNA o RNAi, o aún de la proteína recombinant. ¡Proveemos de usted toda la información de fondo, los protocolos para el transfection de la célula, los pasos de progresión de la optimización y del análisis, e información de localización de averías del transfection de la célula para hacer el último experto!
Transfection describe la introducción del material no nativo en las células eukaryotic usando un vector del virus u otros medios de la transferencia.
El transfection del término para los métodos no-virales se utiliza lo más a menudo posible en referencia a las células mamíferas, mientras que la transformación del término se prefiere para describir transferencia no-viral de la DNA en bacterias y células eukaryotic del no-animal tales como hongos, algas y plantas.
Transfection de las células animales implica típicamente el abrir de poros o de los ' agujeros transitorios en la membrana del plasma de la célula, para permitir el uptake del material. El material genético (por ejemplo supercoiled construcciones de la DNA o del siRNA del plasmid), o aún las proteínas tales como anticuerpos, puede ser transfected. Además del electroporation, el transfection puede ser realizado mezclando un lípido catiónico con el material para producir las liposomas, que se funden con la membrana del plasma de la célula y depositan su cargo adentro.
El significado original del transfection era ' infección por la transformación ', es decir introducción de la DNA (o del RNA) de un virus o de un bacteriófago del eukaryote en las células, dando por resultado una infección. Porque la transformación del término tenía otro sentido en la biología animal de la célula (un cambio genético permitiendo la propagación a largo plazo en cultura, o la adquisición de las características típicas de las células de cáncer), el transfection del término adquirió, para las células animales, su actual significado de un cambio en las características de la célula causadas por la introducción de la DNA.
Transfection es un método por el cual la DNA experimental se puede poner en una célula mamífera cultivada. Tales experimentos se realizan usando la DNA reproducida que contiene secuencias de codificación y controlan generalmente las regiones (promotores, etc) para probar si la DNA será expresada. Puesto que la DNA reproducida se pudo haber modificado extensivamente (por ejemplo, los sitios obligatorios de la proteína en el promotor pudieron haber sido alterados o haber sido quitados), el transfection se utiliza a menudo para probar si una modificación determinada afecta la función de un gene.
Diagrama De Transfection:
La capacidad sintetiza el RNA en el laboratorio es crítica a muchas técnicas. Las puntas de prueba radiactivas y no-radiactivas del RNA se requieren para muchos protocolos, y pueden ser sintetizadas fácilmente en reacciones ines vitro de la transcripción de la escala pequeña permitiendo su uso en hibridaciones de la mancha blanca /negra y análisis de la protección del nuclease.
La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleotide, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio
La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleotide, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio
Hay varios métodos de introducir la DNA no nativa en una célula eukaryotic. Muchos materiales se han utilizado como portadores para el transfection, que se puede dividir en tres clases: polímeros, liposomas y nanoparticles (catiónicos).
Uno (y menos confiables) de los métodos más baratos es transfection al lado del fosfato de calcio, descubierto originalmente por F. L. Graham y A. J. van der Eb en 1973[citation necesitado ] (véase también [ 1 ]). la solución salina HEPES-protegida (HeBS) que contiene los iones del fosfato se combina con una solución del cloruro de calcio que contiene la DNA para ser transfected. Cuando se combinan los dos, un precipitado fino del calcio positivamente cargado y del fosfato negativamente cargado formará, atando la DNA para ser transfected en su superficie. La suspensión del precipitado entonces se agrega a las células para ser transfected (generalmente una cultura de célula crecida en un monolayer). Por un proceso entendido no enteramente, las células toman alguno del precipitado, y con él, la DNA.
Otros métodos utilizan los compuestos orgánicos altamente ramificados, dendrimers supuestos, para atar la DNA y para conseguirla en la célula. Un método muy eficiente es la inclusión de la DNA a ser transfected en las liposomas, es decir los cuerpos pequeños, membrana-limitados que están de algunas maneras similares a la estructura de una célula y pueden fundirse realmente con la membrana de la célula, release/versión la DNA en la célula. Para las células eukaryotic, el li'pido-catio'n basado transfection se utiliza más típicamente, porque las células son más sensibles.
Otro método es el uso de polímeros catiónicos tales como DEAE-dEAE-dextran o polyethylenimine. La DNA negativamente cargada ata al polycation y el complejo es tomado por la célula vía endocytosis.
Un acercamiento directo al transfection es el arma del gene, donde la DNA se junta a un nanoparticle de un sólido inerte (comúnmente oro) que entonces "se tire" directamente en el núcleo de la célula de la blanco. La DNA se puede también introducir en las células usando virus como portador. En tales casos, la técnica se llama transduction viral, y, las células serían transduced.
Otros métodos de transfection incluyen el nucleofection, electroporation, choque del calor, magnetofection y los reactivo propietarios del transfection tales como Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene o DreamFect.
Para la mayoría de las aplicaciones del transfection, es suficiente si transfected el gene se expresa solamente transitorio. Puesto que la DNA introducida en el proceso del transfection no se inserta generalmente en el genoma nuclear, la DNA no nativa se pierde en la fase más posterior cuando las células experimentan la mitosis. Si es que transfected gene deseado permanece realmente en el genoma de la célula y sus células de la hija, un transfection estable deben ocurrir.
Lograr esto, otro gene es el co-transfected-transfected, que da a célula una cierta ventaja de la selección, tal como resistencia hacia cierta toxina. Algo (muy pocos) de transfected las células, por la ocasión, habrá insertado el material genético no nativo en su genoma. Si la toxina, hacia la cual el gene co-transfected-transfected ofrece resistencia, entonces se agrega a la cultura de célula, sólo esas pocas células con los genes no nativos insertados en su genoma podrán proliferar, mientras que otras células morirán. Después de aplicar esta presión de la selección por una cierta hora, solamente sigue habiendo y se puede cultivar las células con un transfection estable más lejos.
Un agente común para el transfection estable es Geneticin, también conocido como G418, que es una toxina que se puede neutralizar por el producto del gene resistente del neomycin.
La transcripción in vitro requiere un modelo linear purificado de la DNA que contiene a un promotor, trifosfatos del ribonucleotide, un sistema del almacenador intermediario que incluya DTT y el magnesio
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