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Contaminación Del Mycoplasma & Cultura De Célula

Incluimos aquí para los laboratorios de la cultura de célula, la información sobre contaminaciones del mycoplasma y las discusiones más últimas del foro del mycoplasma para todas sus preguntas y discusiones de la contaminación.

Fondo Del Mycoplasma

Mycoplasmas es un género de las bacterias que faltan una pared de célula. debido a una carencia de una pared de célula, son resistente a muchos antibióticos incluyendo la penicilina o a otros antibióticos del beta-beta-lactam que apunten síntesis de la pared de célula.

El mycoplasma es parásito o saprophytic. Vario el mycoplasma enfermedad-esta' causando en seres humanos, incluyendo pneumoniae del M., que es una causa importante de la pulmonía anormal y de otros desórdenes respiratorios, y el genitalium del M., que se cree ser implicado en enfermedades inflamatorias pélvicas. Pueden causar o contribuir a algunos cánceres.

Género Mycoplasma

El género mycoplasma es uno de varios géneros dentro de la clase Mollicutes. Mollicutes es las bacterias que tienen genomas pequeños, faltan una pared de célula y tienen un Cromatografi'a-contenido bajo (18-40 %).

Hay sobre 100 especies reconocidas del género mycoplasma. Su talla del genoma se extiende a partir de 0.58 1.38 megabase-pares. Mollicutes es parásitos o commensals de seres humanos, de animales (insectos incluyendo), y de plantas; el género mycoplasma está por la definición restringida a los ordenadores principal vertebrados. El colesterol se requiere para el crecimiento de la especie del género mycoplasma así como ciertos otros géneros de mollicutes. Su temperatura óptima del crecimiento es a menudo la temperatura de su ordenador principal si warmbodied (e.g. 37 grados de centígrado en seres humanos) o temperatura ambiente si el ordenador principal no puede regular su propia temperatura interna. El análisis de las secuencias ribosomal del RNA 16S tan bien como contenido del gene sugiere fuertemente que los mollicutes, incluyendo los mycoplasmas, estén relacionados de cerca con el lactobacilo o la ramificación del clostridium del árbol phylogenetic (stricto del sensu de Firmicutes).

Líneas y Mycoplasmas de la célula

En culturas de célula, los mycoplasmas pueden inducir cambios celulares, incluyendo aborations del cromosoma, cambios en metabolismo y crecimiento de la célula. Las infecciones severas del mycoplasma pueden destruir una línea de la célula o rendir las líneas costosas o preciosas de la célula inútiles.

Contaminación de la cultura de célula con mycoplasma

Mycoplasmas se encuentra a menudo en laboratorios de investigación como los contaminantes en cultura de célula. La contaminación mycoplasmal de la cultura de célula ocurre debido a la contaminación de individuos o de ingredientes contaminados del medio de cultivo de célula.

Métodos De Detección Del Mycoplasma

Las células del mycoplasma son generalmente más pequeñas de 1 µm y por lo tanto absolutamente difíciles de detectar con métodos convencionales de la microscopia. Las técnicas de la detección incluyen:

• PCR
• PCR En tiempo real
• Laminado en agar sensible
• Manchas de la DNA incluyendo DAPI u o la mancha de Hoescht

Protocolo De la Detección De la Contaminación Del Mycoplasma De la Mancha De Hoechst

Un Hoechst (sigma, catálogo #:H6024) manchando el método para el mycoplasma:

1. Para las células adherentes, coloque un cristal estéril de la cubierta en el plato de petri. Agregue 2-3 gotas de la suspensión de la célula en el centro de coverglass (dependiendo del índice de crecimiento de sus células).
2. Entonces agregue cuidadosamente 2-3 ml de media sin disturbar las células. Crezca las células hasta que son 50 -70% confluentes.

Células Que fijan:

1. Prepare el fijador de la célula que es un metanol del fo 3:1 de la mezcla: ácido acético glacial (M:AA). Se cerciora de usted preparar esto fresco antes de uso.
2. Deseche el media de las células cada vez mayor. Agregue 2 ml del metanol: solución glacial del ácido acético M:AA gota a gota sobre la cara de la placa (no no directamente sobre las células). Remolina la placa y desecha la solución.
3. Agregue 2 ml de M:AA, remoline y váyase encendido por 2-3 minutos en la temperatura ambiente.
4. Descarte M: Solución y aclaración del AA con agua
5. Váyase a la concentración común seca de la mancha de Hoecht del aire (usted puede guardar la placa hasta que usted es listo mancharse) (gato # 33258 de sigma) = 0.1 mg/ml en agua que usted puede filtrarse esteriliza en esta etapa con los 0.2uM el envase del abrigo del filtro en almacén del papel de aluminio en la solución de trabajo de 4 oC prepara fresco como necesario hace cada vez la dilusión de 1:1000 (0.1 µg/ml) de la acción en agua

Manchar Las Células:

1. Agregue bastante mancha de Hoechst para cubrir el resbalón entero de la cubierta (uso 1-2ml para un plato de petri pequeño).
2. Deje la mancha encendido por 45 minutos - 1 hora (en la obscuridad).
3. Aclare bien con agua.
4. Monte en una diapositiva del microscopio (mezcla mountant: 22 milímetros de ácido cítrico; 55.6 milímetros de fosfato disodium; glicerol del 50%, mezcla del pH 5.5) al lugar una gota o dos en el resbalón de la cubierta (células para arriba) y el resbalón de la cubierta del lugar (células abajo) en diapositiva.
5. Visualice bajo el microscopio de la fluorescencia

Nota: salve la mancha de Hoechst en 4oC por lo menos, o la parte alícuota en el congelador para el almacenamiento de larga duración.