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Protocolo del aislamiento del protoplasto



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Protocolo del aislamiento del protoplasto

protoplasto

Preparación de protoplastos metabólico competentes

 

Saji Menon y Vibha Tyagi
Instituto de Birla de la investigación científica, círculo de la estatua, Jaipur (Rajasthán), la India

 

Materiales requeridos para el aislamiento del protoplasto

  • Etanol del 70%
  • 0.1% Cloruro mercúrico
  • manitol de los 0.5M

 

  • Solución de la enzima:
  • Celulasa 0.25% Macerozyme R-10 del 1%
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • manitol de los 0.5M (pH 5.6)

 

  • Media que se lava del protoplasto de la célula:
  • manitol de los 0.5M (pH 5.6)
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • Medio de cultivo modificado del protoplasto       

(El vector es mencionado abajo)

 

Protocolo para la preparación de protoplastos metabólico competentes

  • Tome las hojas frescas a partir de 4-5 plantas aséptico crecientes viejas de la semana.
  • La superficie esteriliza en el etanol del 70% seguido tratando con 0.1% cloruros mercúricos para 1 minuto.
  • Lave las hojas a conciencia con agua destilada estéril.
  • Pele la epidermis más baja del tejido de la hoja y coloqúela en la solución del manitol de los 0.5M para una hora en un petriplate.
  • Quite la solución del manitol y substitúyala por la solución estirilizada con filtro por filtración de la enzima.
  • Incube las placas en la obscuridad por 16-20 horas en 25oC.
  • Separe la capa del protoplasto por la filtración usando la membrana del nilón de los 0.45µM.
  • Centrifugue el líquido filtrado en 1000g por 10 minutos en 4 Oc.
  • Quite el sobrenadante y suspenda de nuevo la pelotilla en media que se lava del protoplasto de la célula.
  • Centrifugue en 1000g por 10 minutos.
  • Relance el paso de progresión 9 dos veces.
  • Finalmente suspenda la pelotilla del protoplasto en una densidad de 1*105 ml/l en el medio de cultivo modificado del protoplasto.
  • Platee los protoplastos como muy bien capa delgada en petriplates.
  • Incube las placas en 25 Oc en obscuridad.

 

Medio de cultivo modificado del protoplasto

S.No.

Componentes

Cantidad

A

Sales minerales

 

1

Nitrato de amonio

82.5 gm/l

2

Nitrato de potasio

95.0 gm/l

3

Ácido bórico

1190 mg/l

4

Fosfato de biácido del potasio

34 mg/l

5

Yoduro de potasio

166 mg/l

6

Molibdato del sodio

250 mg/l

7

Dihidrato del cloruro del cobalto

25.0 mg/l

8

Dihidrato del cloruro de calcio

88.0 gm/l

9

Heptahidrato del sulfato de magnesio

74.0 gm/l

10

Tetrahidrato del sulfato del manganeso

4460 mg/l

11

Heptahidrato del sulfato de cinc

1720 mg/l

12

Pentahidrato del sulfato de cobre

25.0 mg/l

13

Sal disódica diamina del ácido acético del etileno tetra

7.45 gm/l

14

Heptahidrato del sulfato ferroso

5.57 gm/l

B

Azúcares

 

1

Glucosa

30.0 gm/l

2

Ribosa

0.5 gm/l

3

Manosa

0.5 gm/l

4

Sorbitol

0.5 gm/l

C

Ácidos orgánicos

 

1

Piruvato del sodio

5.0 mg/l

2

Ácido cítrico

10.0 mg/l

3

Ácido málico

10.0 mg/l

D

Vitaminas

 

1

Clorhidrato de la tiamina

100 mg/l

2

Niconamida

500 mg/l

3

Clorhidrato de la piridoxina

500 mg/l

4

Pantotenato del calcio

250 mg/l

5

Biotina

100 mg/l

6

Ácido ascórbico

75.0 mg/l

7

Riboflavina

50.0 mg/l

8

Inositol

100 gm/l

E

Hormonas

 

1

ácido acético fenoxi 2,4-Dichloro (2,4-D)

0.5 mg/l

2

Purina amino bencílica (BAP)

1.0 mg/l