Protocolo Del Aislamiento Del Protoplasto

Preparación de protoplastos metabólico competentes

Saji Menon y Vibha Tyagi
Instituto de Birla de la investigación científica, círculo de la estatua, Jaipur (Rajasthán), la India

(el vector se enumera abajo)

Hojas frescas de la toma a partir de 4-5 viejas plantas aséptico crecientes de la semana.
La superficie esteriliza en el etanol del 70% seguido tratando con 0.1% cloruro mercúrico para 1 minuto.
Lave las hojas a conciencia con agua destilada estéril.
Pele la epidermis más baja del tejido fino de la hoja y coloqúela en la solución del mannitol de los 0.5M para una hora en un petriplate.
Quite la solución del mannitol y substitúyala por la solución estirilizada con filtro por filtracio'n de la enzima.
Incube las placas en la obscuridad por 16-20 horas en 25oC.
Separe la capa del protoplasto por la filtración usando la membrana del nilón de los 0.45µM.
Centrifugue el líquido filtrado en 1000g por 10 minutos en el oC 4.
Quite el supernatant y suspenda de nuevo la pelotilla en media que se lava del protoplasto de la célula.
Centrifugue en 1000g por 10 minutos.
Relance el paso de progresión 9 dos veces.
Finalmente suspenda la pelotilla del protoplasto en una densidad de 1*105 ml/l en el medio de cultivo modificado del protoplasto.
Platee los protoplastos como muy bien capa delgada en petriplates.
Incube las placas en el oC 25 en obscuridad.

S.No.	Componentes	Cantidad
A	Sales Mineral
1	Nitrato De Amonio	82.5 gm/l
2	Nitrato Del Potasio	95.0 gm/l
3	Ácido bórico	1190 mg/l
4	Fosfato De Dihydrogen Del Potasio	34 mg/l
5	Yoduro Del Potasio	166 mg/l
6	Molybdate Del Sodio	250 mg/l
7	Dihydrate Del Cloruro Del Cobalto	25.0 mg/l
8	Dihydrate Del Cloruro De Calcio	88.0 gm/l
9	Sulfato Heptahydrate Del Magnesio	74.0 gm/l
10	Tetrahydrate del sulfato del manganeso	4460 mg/l
11	Sulfato Heptahydrate Del Cinc	1720 mg/l
12	Pentahydrate Del Sulfato De cobre	25.0 mg/l
13	Sal disodium diamino del ácido acético del etileno tetra	7.45 gm/l
14	Heptahydrate del sulfato ferroso	5.57 gm/l
B	Azúcares
1	Glucosa	30.0 gm/l
2	Ribose	0.5 gm/l
3	Mannose	0.5 gm/l
4	Sorbitol	0.5 gm/l
C	Ácidos Orgánicos
1	Pyruvate Del Sodio	5.0 mg/l
2	Ácido cítrico	10.0 mg/l
3	Ácido málico	10.0 mg/l
D	Vitaminas
1	Clorhidrato De la Tiamina	100 mg/l
2	Niconamida	500 mg/l
3	Clorhidrato Del Pyridoxine	500 mg/l
4	Pantothenate del calcio	250 mg/l
5	Biotin	100 mg/l
6	Ácido ascórbico	75.0 mg/l
7	Riboflavina	50.0 mg/l
8	Inositol	100 gm/l
E	Hormonas
1	Ácido Acético Phenoxy 2,4-Dichloro (2,4-D)	0.5 mg/l
2	Purine Amino Benzyl (BAP)	1.0 mg/l