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Anticuerpos De Polyclonal

Todo sobre los anticuerpos del polyclonal.

Recursos Externos Relacionados Del Anticuerpo De Polyclonal - Protocolos:

• Mancha blanca /negra Occidental
• Immunoblot
• Inmunoprecipitación (IP)
• Creación de anticuerpos usando los peptides

También estación del anticuerpo de la visita para más en los anticuerpos de Polyclonal. Es un sitio nuevo que enumera a surtidores del anticuerpo, aprende sobre los anticuerpos, y los protocolos.

Protocolos del anticuerpo de Polyclonal:

• Ratones De Inmunización
• Preparación del suero de la sangre
• Inmunización Del Conejo
• Procedimiento de la sangría del conejo
• Obtención del suero
• Precipitación del sulfato del amonio de IgG del suero
• Inmunización
• Protocolo de ELISA para la investigación del anticuerpo de Polyclonal

Anticuerpo De Polyclonal

 

Los anticuerpos de Polyclonal son anticuerpos derivados de muchas B-ce'lulas o líneas de la B-ce'lula, similares a la mezcla de los anticuerpos encontrados en sueros de sangre.

Los anticuerpos de Polyclonal son por lo tanto una mezcla de muchas diversas especificidades del anticuerpo.

Las preparaciones del anticuerpo de Polyclonal compradas son mezclas de los anticuerpos de muchas diversas especificidades al mismo antígeno.

La inmunización del conejo, del ratón, de la cabra, del pollo, o del otro animal produce los anticuerpos del polyclonal. Los sueros animales se pueden utilizar directamente, no obstante es mejor purificar los anticuerpos del polyclonal para el uso del laboratorio.

Preparación Del Anticuerpo De Polyclonal

De acuerdo con el protocolo por el Dr. David Bowtell

Inmunización de ratones:

Las inyecciones para inmunizar los ratones para la generación de los anticuerpos del polyclonal se deben hacer en los intervalos por lo menos de dos semanas separadas.

Los 2 coadyuvantes siguientes han sido acertados:

• Coadyuvante de Freund y coadyuvante de MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Research, Inc.). El MPL es menos peligroso que el primer coadyuvante.

1. Para la primera inyección de la inmunización: inyecte 15 - 50 ug si antígeno en el coadyuvante de la UL 200, inyectado subcutáneo.
2. La segunda inyección debe ocurrir 2 semanas más adelante; Usted debe entonces alzar con 15 - 50 ug del antígeno en coadyuvante. (si el tiempo permite, alce otra vez un mes más adelante).
3. Sangra siete a 10 días más adelante el suero del ratón y de la prueba usando el análisis que será utilizado para la investigación. Si no es el título arriba bastante, alza otra vez dos semanas después del alza anterior.

TAPA

Preparación Del Suero:

1. Después de recoger, la sangre se debe permitir coagular por 60 minutos. en 37°C u O.N en 4°C.
2. Separe el coágulo de las caras del tubo (sonido) que usa una pipeta del pasteur. Coloque el coágulo en 4°C O.N.
3. Haga girar en 10000 x g por 10 min. en 4°C para separar el suero.
4. El suero se puede salvar en -20°C después de agregar el glicerol hasta el 50%.

Si es monoclonal se desean los anticuerpos, una vez que usted haga que un "buen" polyclonal y un método de investigación confiable procedan al paso de progresión siguiente.

TAPA

Conejos:

Los conejos se inmunizan esencialmente según lo descrito arriba. Inyecciones:

1. Primero en la inyección completa 100-200ug/1ml de Freund, dos sitios (sobre cada hombro).
2. En segundo lugar 1 mes más adelante en Freund INCOMPLETO como arriba.
3. Corrimiento 2 semanas más adelante. Alza 2 semanas más adelante otra vez (ciclo de 2 + 2 semanas).

TAPA

 

PRODUCCIÓN DE LOS ANTICUERPOS DE POLYCLONAL EN LOS CONEJOS (BLANCO DE NEUSEELAND)

De acuerdo con el protocolo por Dr.Walter Steffen.

Los conejos deben ser 3-4 kilogramos en el peso y cerca de 3 meses de viejo. Sobre un tercero del conejo tenga anticuerpos e immunoactivity endógenos de la contra-queratina para los componentes celulares otros. Esto acentúa la importancia de tomar el suero pre-inmune de cualquier conejo dado.

Almacenadores intermediarios y soluciones:

• Solución saturada del sulfato del amonio, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
• 50 milímetros de acetato del amonio, pH 8.0
• etanol del 70%
• Coadyuvante de Freund (completo y incompleto)
• Salino protegida fosfato (PBS) (véase abajo)
• Vaselina
• Xileno

TAPA

• Traiga el conejo de su jaula y coloqúelo con seguridad en un rectángulo que refrena que sale del oído accesible. Guarde la calma del conejo relativamente. Los volúmenes de sangre hasta 50 ml se pueden recoger fácilmente de la arteria principal que se ejecuta abajo del centro de la superficie dorsal del oído.
• Afeite el oído izquierdo alrededor de la vena izquierda con una hoja de afeitar fresca.
• Limpie el oído con etanol o el isopropanol del 70%.
• Limpie el oído con el xileno alrededor de bucle de la arteria-vena para dilatar.
• Lleve a cabo la extremidad del oído (firmemente) y del tubo de la colección en una mano y con el separador de millares libre de la mano una aguja hipodérmica 19G en la arteria dilatada. La sangre debe comenzar a fluir inmediatamente en el tubo de la colección. Para los mejores resultados utilice una porción de la arteria situado a mitad del camino a lo largo del oído.
• Recoja hasta 50 ml de sangre. Aplique la presión apenas anterior a la punta de la entrada de la aguja a la sangría de la parada.
• Aplique la vaselina al oído para calmar la irritación del xileno.
• Ponga la vaselina adicional en corte.

Obtención Del Suero:

TAPA

• Tubo de remolino con la sangre recogida para cubrir la superficie y para prevenir la conexión del coágulo al tubo.
• Incube en el oC 37 para 1 hora.
• Centrifugue en 2.500 g (que fija #7 en una tapa de vector clínica) por 10 minutos.
• Quite el coágulo y haga girar el suero en 3.000 g por 10 minutos.
• El suero se debe salvar congelado.

Precipitación del sulfato del amonio de IgG del suero (oC 4, realizado en cámara fría):

La precipitación del sulfato del amonio es un método fácil para obtener una fracción bastante pura de IgG.

TAPA

• Suero de la piscina a partir de un conejo
• Suero del peso
W1 = _____ g
• Tubos de la colada con el minuto. PBS y pesan otra vez.
W2 = _____ g
• Agregue 2/3 volumen de sulfato saturado W2 del amonio, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
Nota: agregue muy lentamente, gota a gota mientras que revuelve en el oC 4 o utilice la bomba peristáltica.
• Revuelva por 15 minutos.
• Transferencia a los tubos de centrifugadora de 40 ml; cubilete de la colada con 3 porciones de PBS: 2 porciones de sulfato del amonio y agrega a los tubos.
• Vuelta en 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 RPM) por 10 minutos.
• Deseche el supernatant.
• Suspenda de nuevo la pelotilla en PBS [ el 1/2 W1 el = 1/2 vol.. ].
• Haga girar en 12.000 g por 10 minutos, deseche la pelotilla.
• Recoja el supernatant en el cubilete, paredes de la colada con PBS.
Determínese W3 = _____
• Agregue 2/3 vol.. Sulfato saturado W3 del amonio, mientras que revuelve. Continúe revolviendo por 15 minutos.
• Transfiera la suspensión a los tubos de centrifugadora de 40 ml, tubo de la colada con la solución del sulfato de PBS/ammonium.
• Haga girar en 12.000 g por 10 minutos.
• Deseche el supernatant.
• Suspenda de nuevo las pelotillas en 1/4 W1 PBS.
• Dialice contra PBS, 3-times 6 horas por cada uno.
• Ponga el suero en un tubo graduado, bolso de la diálisis de la aclaración bien con PBS.
• Traiga el hasta 1/2 W1 el = 1/2 vol. en PBS.
• Determine la concentración y la parte alícuota de la proteína para el almacenaje. Mida la absorción en 280 nm. La absorción de 1 solución de mg/ml IgG es aproximadamente 1.5.

Inmunización:

TAPA

• Disuelva el antígeno de ~400-600 g (~200-300 g por la inyección) en 2.2 ml 50 milímetros de acetato del amonio, almacenador intermediario apropiado del pH 8.0 u otro. La concentración depende del antigenicity de la proteína que se inyectará.
• La cantidad de antígeno necesitada para inmunizar un animal depende de ella antigenicity y el método de inmunización. Si las proteínas con antigenicity bajo se utilizan, será provechoso desnaturalizar la proteína con una concentración baja de SDS (hasta 0.2%). Solamente el antígeno altamente purificado se debe utilizar para la producción de los anticuerpos del polyclonal. Un método fácil para obtener un antígeno puro está por SDS-PAGE. Las proteínas se pueden transferir a una hoja de la nitrocelulosa, manchar con Ponceau S, cortar con una hoja de afeitar, y utilizar como antígeno (busque los protocolos estándares en SDS-PAGE).
• Trace encima del coadyuvante completo de 1.1.ml Freund con una aguja hipodérmica 20G, después trace encima de 1.1 ml de solución del antígeno. Congele los 1.1 ml restantes para el alza.
• Manteniendo el émbolo inmóvil, quite la aguja y asocie una llave de paso estéril 3-way.
• Mezcle el antígeno con el coadyuvante asociando una segunda jeringuilla de cristal a la llave de paso e inyectándola hacia adelante y hacia atrás. (precaución: algunas jeringuillas plásticas pudieron reaccionar con el aceite mineral.)
• Una emulsión completa será formada después de cerca de 20-30 minutos; indicado por un aumento algo repentino en la viscosidad de la solución.

Precaución: ¡sea seguro que el montaje es seguro!
• Después de espera que se mezcla cerca de 20 minutos antes de la inyección al control que la mezcla es completa (si es incompleto, el aceite se separará).
• Afeite detrás de conejo de las láminas del hombro a la pelvis.
• Limpie detrás con etanol o el isopropanol del 70%
• Inyecte bajo la piel en cerca de 10-20 caras a lo largo de la espina dorsal entre la lámina del hombro y la pelvis usando una aguja hipodérmica 21G. (nota: Primera inyección una semana después de la sangría pasada del preimmune).
• Espere un mes y álcelo con una mezcla del antígeno y del coadyuvante incompleto. Evite las cicatrices de la inyección anterior.
• Sangre después de una semana para controlar para saber si hay inmune-respuesta. El alza debe ser relanzada, si la inmunorespuesta era demasiado débil; sin embargo, un diverso conejo debe ser elegido, si el conejo no reaccionó en todo /LI >

Referencias: Garvey, J.S., Cremer, Noreste, Y Sussdorf, ADO (1977) En: Métodos en inmunología. Publicación. El Benjamin/Cummings Publishing Company. Masa De las Lecturas. pp 545

TAPA

Investigación del anticuerpo de Polyclonal usando análisis de ELISA

Protocolo de ELISA para la pantalla del anticuerpo:

Materiales para ELISA:

placas del ° - 96 receptor de papel Dynatech Immulon, tipo 2. (pescador 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% tween 20 o TBS + 0.1% tween 20.

° que bloquea la solución el = 2% BSA (tipo V) en PBS. (agregue 0.02% azide para un almacenaje más largo.)

almacenador intermediario de Elisa del ° el = 2% BSA + 0.1% tween 20 en PBS (azide opcional).

anticuerpo del ° = peroxidase conectados enzima 1 del rábano picante

substrato del ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001)1

almacenador intermediario del ° HRP: ácido cítrico del magnesio del citrato pH 4.2(490 del Na del 100mM + citrato del Na del magnesio 720

dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2).

peróxido de hidrógeno del ° el 30% (1000X)

TAPA

Protocolo de ELISA para el anticuerpo de Polyclonal

1) ADSORBTION DEL ANTÍGENO

a) AG diluído a 10 ug/ml en PBS.

b) Agregue UL 100 de la solución del AG a cada uno bien.

c) Deje O.N cubierto con el abrigo de saran, en 4°C.

2) BLOQUEO

a) El AG desatado de la colada invirtiendo las placas y chasqueando los receptores de papel se seca.

b) Aclaración agregando PBS a cada uno receptor de papel e invirtiéndolo otra vez (el uso arroja a chorros la botella).

c) Relance la aclaración dos veces.

d) Agregue UL 100 de bloquear la solución a cada bien, deje 1 hora en la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

3) ANTICUERPO PRIMARIO

a) Agregue el anticuerpo que se probará:

Sup de células = UL 25, se mezcla bien pipeting hacia arriba y hacia abajo (10 veces).

suero, ascitis = 1:100 y un serie de 1/5 de las dilusiones. Haga las dilusiones en el bloqueo de la solución.

b) Deje 1 hora en la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

4) ANTICUERPO SECUNDARIO

a) Anticuerpo desatado de la colada 4 veces con PBS + 0.1% tween 20.

b) Agregue UL 100 del anticuerpo conectado enzima a todos los receptores de papel. Haga las dilusiones apropiadas en el almacenador intermediario de Elisa. (ex: HRP es 2000X).

c) Deje 1 hora en la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

5) SUBSTRATO

a) Substrato de Disolve en agua.

b) Placa de la colada 4 veces con PBS + 0.1% tween 20 (uso TBS en vez de PBS para el AP).

c) Agregue UL 100 del substrato a cada receptor de papel.

d) Mire el desarrollo del color. Esto podía tomar a partir de algunos segundos a 20 minutos.

e) Si está necesitado, pare la reacción agregando UL 50 del NaOH de los 4M.

f) Lea la absorción en el programa de lectura de Elisa en la longitud de onda correcta (para el sistema 416 nm de HRP, para AP - 405 nm).

TAPA

Otros Web site Del Anticuerpo

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