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Anticuerpos policlonales

Todo sobre los anticuerpos policlonales.

Recursos externos relacionados del anticuerpo policlonal - protocolos:

También estación del anticuerpo de la visita para más en los anticuerpos policlonales. Es un nuevo sitio que enumera a surtidores del anticuerpo, aprende sobre los anticuerpos, y los protocolos.

Protocolos policlonales del anticuerpo:

Anticuerpo policlonal

Los anticuerpos policlonales son anticuerpos derivados de muchas B-células o líneas de la B-célula, similares a la mezcla de anticuerpos encontrados en sueros de sangre.

Los anticuerpos policlonales son por lo tanto una mezcla de muchas diversas especificidades del anticuerpo.

Las preparaciones policlonales del anticuerpo compradas son mezclas de anticuerpos de muchas diversas especificidades al mismo antígeno.

La inmunización del conejo, del ratón, de la cabra, del pollo, o del otro animal produce los anticuerpos policlonales. Los sueros animales se pueden utilizar directamente, no obstante es mejor purificar los anticuerpos policlonales para el uso del laboratorio.

Preparación policlonal del anticuerpo

De acuerdo con el protocolo por el Dr. David Bowtell

Inmunización de ratones:

Las inyecciones para inmunizar los ratones para la generación de anticuerpos policlonales se deben hacer en los intervalos por lo menos de dos semanas separadas.

Los 2 coadyuvantes siguientes han sido acertados:

Coadyuvante de Freund y coadyuvante de MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Research, Inc.). El MPL es menos peligroso que el primer coadyuvante.

Para la primera inyección de la inmunización: inyecte 15 - 50 ug si antígeno en el coadyuvante de la UL 200, inyectado subcutáneo.
La segunda inyección debe ocurrir 2 semanas más adelante; Usted debe entonces alzar con 15 - 50 ug del antígeno en coadyuvante. (Si el tiempo permite, alce otra vez un mes más adelante).
Sangra siete a 10 días más adelante el suero del ratón y de la prueba usando el análisis que será utilizado para la investigación. Si no es el título arriba bastante, alza otra vez dos semanas después del alza anterior.

TAPA

Preparación del suero:

Después de recoger, la sangre se debe permitir coagular por 60 Min. en 37°C u O.N en 4°C.
Separe el coágulo de las caras del tubo (sonido) usando una pipeta del pasteur. Coloque el coágulo en 4°C O.N.
Haga girar en 10000 x g por 10 Min. en 4°C para separar el suero.
El suero se puede salvar en -20°C después de agregar el glicerol hasta el 50%.

Si se desean los anticuerpos monoclonales, una vez que usted hace que un “buen” método de cribado policlonal y confiable proceda al paso de progresión siguiente.

TAPA

Conejos:

Los conejos se inmunizan esencialmente como se describe anteriormente. Inyecciones:

Primero en la inyección completa 100-200ug/1ml de Freund, dos sitios (sobre cada hombro).
En segundo lugar 1 mes más adelante en Freund INCOMPLETO como arriba.
Corrimiento 2 semanas más adelante. Alza 2 semanas más adelante otra vez (ciclo de 2 + 2 semanas).

TAPA

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES EN LOS CONEJOS (BLANCO DE NEUSEELAND)

De acuerdo con el protocolo por Dr.Walter Steffen.

Los conejos deben ser 3-4 kilogramos en peso y cerca de 3 meses. Sobre un tercero del conejo tenga anticuerpos e immunoactivity endógenos de la anti-queratina para los otros componentes celulares. Esto acentúa la importancia de tomar el suero pre-inmune de cualquier conejo dado.

Almacenadores intermediarios y soluciones:

Solución saturada del sulfato del amonio, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
50 milímetros de amonio acetato, pH 8.0
etanol del 70%
Coadyuvante de Freund (completo y incompleto)
Salino protegida fosfato (PBS) (véase abajo)
Vaselina
Xileno

TAPA

Traiga el conejo de su jaula y coloqúelo con seguridad en un rectángulo de refrenamiento que sale del oído accesible. Guarde la calma del conejo relativamente. Los volúmenes de sangre hasta 50 ml se pueden recoger fácilmente de la arteria principal que se ejecuta abajo del centro de la superficie dorsal del oído.
Afeite el oído izquierdo alrededor de la vena izquierda con una hoja de afeitar fresca.
Limpie el oído con etanol o el isopropanol del 70%.
Limpie el oído con el xileno alrededor de bucle de la arteria-vena para dilatar.
Lleve a cabo la extremidad del oído (firmemente) y del tubo de la colección en una mano y con el separador de millares de la carta blanca una aguja hipodérmica 19G en la arteria dilatada. La sangre debe comenzar a fluir inmediatamente en el tubo de la colección. Para los mejores resultados utilice una porción de arteria situado a mitad del camino a lo largo del oído.
Recoja hasta 50 ml de sangre. Aplique la presión apenas anterior a la punta de la entrada de la aguja para parar el sangrar.
Aplique la vaselina al oído para calmar la irritación del xileno.
Ponga la vaselina adicional en corte.

Obtención del suero:

TAPA

Tubo de remolino con la sangre recogida para cubrir la superficie y para prevenir la conexión del coágulo al tubo.
Incube en 37 Oc para 1 hora.
Centrifugue en 2.500 g (configuración #7 en una tapa de vector clínica) por 10 Min.
Quite el coágulo y haga girar el suero en 3.000 g por 10 Min.
El suero se debe salvar congelado.

Precipitación del sulfato del amonio de IgG del suero (4 Oc, realizado en cámara fría):

La precipitación del sulfato del amonio es un método fácil para obtener una fracción bastante pura de IgG.

TAPA

Suero de piscina a partir de un conejo
Suero del peso

W1 = ___ g

Lave los tubos con PBS mínimo y pese otra vez.

W2 = ___ g

Agregue 2/3 volumen de sulfato saturado W2 del amonio, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0

Nota: agregue muy lentamente, gota a gota mientras que revuelve en 4 Oc o utilice la bomba peristáltica.

Revuelva por 15 Min.
Transferencia a los tubos de centrífuga de 40 ml; cubilete de la colada con 3 porciones de PBS: 2 porciones de sulfato del amonio y agrega a los tubos.
Vuelta en 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 RPM) por 10 Min.
Deseche el sobrenadante.
Suspenda de nuevo la pelotilla en PBS [el 1/2 W1 el = 1/2 vol.].
Haga girar en 12.000 g para el minuto 10, deseche la pelotilla.
Recoja el sobrenadante en el cubilete, paredes de la colada con PBS.

Determine W3 = ___

Agregue 2/3 sulfato saturado W3 del amonio del vol., mientras que revuelve. Continúe el stirring por 15 Min.
Transfiera la suspensión a los tubos de centrífuga de 40 ml, tubo de la colada con la solución del sulfato de PBS/ammonium.
Haga girar en 12.000 g por 10 Min.
Deseche el sobrenadante.
Suspenda de nuevo las pelotillas en 1/4 W1 PBS.
Dialice contra PBS, 3 por 6 horas por cada uno.
Ponga el suero en un tubo graduado, bolso de la diálisis de la aclaración bien con PBS.
Traiga el hasta 1/2 W1 el = 1/2 vol. en PBS.
Determine la concentración y la parte alícuota de la proteína para el almacenaje. Mida la absorción en 280 nanómetro. La absorción de 1 mg/ml solución de IgG es aproximadamente 1.5.

Inmunización:

TAPA

Disuelva el antígeno de ~400-600 g (~200-300 g por la inyección) en 2.2 ml 50 milímetros de amonio acetato, almacenador intermediario apropiado del pH 8.0 u otro. La concentración depende de la antigenicidad de la proteína que se inyectará.
La cantidad de antígeno necesaria para inmunizar un animal depende de ella antigenicidad y el método de inmunización. Si las proteínas con antigenicidad baja se utilizan, será provechoso desnaturalizar la proteína con una concentración baja de SDS (hasta 0.2%). Solamente el antígeno altamente purificado se debe utilizar para la producción de anticuerpos policlonales. Un método fácil para obtener un antígeno puro está por SDS-PAGE. Las proteínas se pueden transferir a una hoja de la nitrocelulosa, manchar con Ponceau S, cortar con una hoja de afeitar, y utilizar como antígeno (busque los protocolos estándar en SDS-PAGE).
Elabore el coadyuvante completo de 1.1.ml Freund con una aguja hipodérmica 20G, después elabore 1.1 ml de solución del antígeno. Congele los 1.1 ml restantes para el alza.
Paso el émbolo inmóvil, quite la aguja y asocie una llave de paso de tres vías estéril.
Mezcle el antígeno con el coadyuvante asociando una segunda jeringuilla de cristal a la llave de paso e inyectándola hacia adelante y hacia atrás. (Precaución: algunas jeringuillas plásticas pudieron reaccionar con el aceite mineral.)
Una emulsión completa será formada después del minuto cerca de 20-30; indicado por un aumento algo repentino en la viscosidad de la solución.

Después del minuto de mezcla cerca de 20 de la espera antes de la inyección a controlar que la mezcla es completa (si es incompleto, el aceite se separará).
Afeite detrás de conejo de las láminas de hombro a la pelvis.
Limpie detrás con etanol o el isopropanol del 70%
Inyecte bajo la piel en cerca de 10-20 caras a lo largo de la espina dorsal entre la lámina de hombro y la pelvis usando una aguja hipodérmica 21G. (Nota: Primera inyección una semana después de la sangría pasada del preimmune).
Espere un mes y álcelo con una mezcla de antígeno y de coadyuvante incompleto. Evite las cicatrices de la inyección anterior.
Sangre después de una semana para controlar para saber si hay inmune-respuesta. El alza debe ser relanzada, si la inmunorespuesta era demasiado débil; sin embargo, un diverso conejo debe ser elegido, si el conejo no reaccionó en absoluto. /LI >

Referencias: Garvey, J.S., Cremer, noreste, y Sussdorf, ADO. (1977) En: Métodos en inmunología. Pub. Benjamin/Cummings Publishing Company. Massachusetts pp 545 de las lecturas

TAPA

Investigación del anticuerpo policlonal usando análisis de ELISA

Protocolo de ELISA para la pantalla del anticuerpo:

Materiales para ELISA:

Placas del ° - 96 receptor de papel Dynatech Immulon, tipo - 2. (Fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% tweenes 20 o TBS + 0.1% tweenes 20.

° que bloquea la solución el = 2% BSA (tipo V) en PBS. (Agregue 0.02% azoturos para un almacenaje más largo.)

Almacenador intermediario de Elisa del ° el = 2% BSA + 0.1% tweenes 20 en PBS (azoturo opcional).

Anticuerpo del ° = peroxidasa conectados enzima 1 del rábano picante

Substrato del ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001) 1

Almacenador intermediario del ° HRP: citrato pH 4.2 (ácido cítrico del Na 100mM del magnesio 490 + citrato del Na del magnesio 720

dihidrato + 50 ml H2O, pH 4.2).

Peróxido de hidrógeno del ° el 30% (1000X)

TAPA

Protocolo de ELISA para el anticuerpo policlonal

1) ADSORBTION DEL ANTÍGENO

a) AG diluído a 10 ug/ml en PBS.

b) Agregue UL 100 de la solución del AG a cada uno bien.

c) Deje O.N cubierto con el abrigo de sarán, en 4°C.

2) BLOQUEO

a) El AG desatado de la colada invirtiendo las placas y chasqueando los receptores de papel se seca.

b) Aclaración agregando PBS a cada uno receptor de papel e invirtiéndolo otra vez (el uso arroja a chorros la botella).

c) Relance la aclaración dos veces.

d) Agregue UL 100 de bloquear la solución a cada bien, deje 1 hora en a la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

3) ANTICUERPO PRIMARIO

a) Agregue el anticuerpo que se probará:

El sorbo de células = UL 25, se mezcla bien pipeting hacia arriba y hacia abajo (10 veces).

suero, ascitis = 1:100 y un serie de 1/5 de las dilusiones. Haga las dilusiones en el bloqueo de la solución.

b) Deje 1 hora en a la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

4) ANTICUERPO SECUNDARIO

a) Anticuerpo desatado de la colada 4 veces con PBS + 0.1% tweenes 20.

b) Agregue UL 100 del anticuerpo conectado enzima a todos los receptores de papel. Haga las dilusiones apropiadas en el almacenador intermediario de Elisa. (ex: HRP es 2000X).

c) Deje 1 hora en a la temperatura ambiente u O.N en 4°C.

5) SUBSTRATO

a) Substrato de Disolve en agua.

b) Placa de la colada 4 veces con PBS + 0.1% tweenes 20 (uso TBS en vez de PBS para el AP).

c) Agregue UL 100 del substrato a cada receptor de papel.

d) Mire el desarrollo del color. Esto podía llevar a partir de algunos segundos 20 Min.

e) Si está necesitado, pare la reacción agregando UL 50 del NaOH de los 4M.

f) Lea la absorción en el programa de lectura de Elisa en la longitud de onda correcta (para el sistema 416 nanómetro de HRP, para AP - 405 nanómetro).

TAPA

Asuntos policlonales del foro del anticuerpo

Cuerdas de rosca
Título/cartel de la cuerda de rosca	Poste pasado	Contestaciones	Opiniónes
Determinación de la oxitocina en muestras biológicas por cromatografía líquida del isocratichigh-funcionamiento con la detección culombiométrica usando la extracción de C18solid-phase y el columnpurification anticuerpo-basado policlonal del immunoaffinity tocoferol	12-31-1969 11:00 P.M. por”	0	117
anti-mamífero policlonal para la mosca chipsalat	09-09-2008 08:20 por el chipsalat ”	0	235
Generación policlonal de los anticuerpos de la purificación recombinante de la proteína Dionisia	03-15-2009 09:03 por MicroKiller ”	2	745

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