Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Η μοριακή βιολογία - αποσπάσματα επιστήμης

Εάν είναι πράσινο ή wriggles, είναι η βιολογία. Εάν βρωμά, είναι χημεία. Εάν δεν λειτουργεί, είναι φυσική. ~Handy οδηγός για την επιστήμη

Μοριακό ενημερωτικό δελτίο της βιολογίας!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

Απομόνωση RNA

Βασικές πληροφορίες εξαγωγής RNA

Η λήψη του υψηλής ποιότητας, άθικτου RNA είναι το πρώτο και συχνά κρισιμότερο βήμα στην εκτέλεση πολλών θεμελιωδών μοριακών πειραμάτων της βιολογίας, συμπεριλαμβανομένης της βόρειας ανάλυσης, των δοκιμών προστασίας νουκλεάσης, του ρτ-πθρ, της χαρτογράφησης RNA, της in vitro μετάφρασης και της κατασκευής βιβλιοθηκών DNA. Για να είναι επιτυχής, εντούτοις, η διαδικασία απομόνωσης RNA πρέπει να περιλάβει μερικά σημαντικά βήματα και τα δύο πριν και μετά από τον πραγματικό καθαρισμό RNA.

Βασικές μέθοδοι απομόνωσης RNA

Ανάλογα με το RNA που εξάγεται, υπάρχουν ιδιότητες του RNA που επιτρέπουν σε το για να απομονωθούν μακρυά από άλλα κυψελοειδή υλικά όπως οι πρωτεϊ'νες, DNA και ακόμη και λιπίδια.

Το RNA αγγελιοφόρων ή mRNA περιέχει τα υπολείμματα ενός τεντωμάτων αδενοσίνης υπό μορφή πολυ (A) ουράς. Αυτό έχει χρησιμοποιηθεί για να επιτρέψει σε mRNA για να δεσμευθεί στις πολυ (T) στήλες ή τις χάντρες συγγένειας.

Ακρες για την εξαγωγή και την απομόνωση RNA

Εάν έχετε αυτήν την περίοδο μια συνιστώμενη μέθοδο για το RNA, συνεχίστε να την χρησιμοποιείτε.

Εάν δεν έχετε απομονώσει το RNA από το σύστημά σας προτού και να μην είσαι ο οργανισμός σας στον ακόλουθο κατάλογο, μπορούμε να σας βοηθήσουμε να προσδιορίσετε τα καθιερωμένα πρωτόκολλα που έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση του RNA για το βόρειο λέκιασμα ή το ρτ-πθρ από το σύστημά σας. Αυτοί οι τύποι πρωτοκόλλων θα παραγάγουν επίσης το RNA "μηθροαρραυ-βαθμού".

Πάντα τρέξτε ένα πήκτωμα αγαρόζης του RNA σας για να αξιολογήσετε την ποιότητα.

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν χρησιμοποιείτε ένα μη βασισμένο στη στήλη αντιδραστήριο καθαρισμού όπως TRIzol συστήνουμε ότι κατακρημνίζετε το RNA σας μια δεύτερη φορά από την αιθανόλη ή το περνάτε μέσω μιας στήλης Rneasy ή μιας παρόμοιας συσκευής. Αυτό ασφαλίζει την αφαίρεση όλων των οργανικών μολυσματικών παραγόντων (Δείτε τα φάσματα κατωτέρω).

RNase ανασταλτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται μεμονωμένα την εξαγωγή και RNA

Έλεγχος της ποιότητας και της ποσότητας απομόνωσης RNA

Αποδοτικό πυρηνικό/κυτταροπλασματικό fractionation μπορεί να αξιολογηθεί γρήγορα από την ανάλυση πηκτωμάτων αγαρόζης μετουσίωσης (δείτε τις ζώνες αριθμού 1). στον πρόδρομο rRNA πρέπει να είναι ισοδύναμος στο συνολικό και πυρηνικό μέρος RNA. Οι ζώνες 18S και 28S rRNA θα είναι λιγότερο έντονες στο πυρηνικό μέρος RNA απ'ό,τι είτε στο συνολικό RNA είτε το κυτταροπλασματικό RNA μέρους. Σε μερικές γραμμές κυττάρων, παραδείγματος χάριν 293 και μαρούλι-7 κύτταρα, αυτή η διαφορά θα είναι δραματικά, αλλά σε άλλες γραμμές κυττάρων όπως τα κύτταρα HeLa, οι ζώνες rRNA είναι μόνο ελαφρώς λιγότερο έντονες στο πυρηνικό RNA απ'ό,τι στο συνολικό ή κυτταροπλασματικό RNA μέρους."

Αγνότητα RNA

A260 οι αναγνώσεις και το 260/280 αναλογιών δεν είναι αρκετές να εξασφαλίσουν RNA υψηλής αγνότητας. Πρέπει να πάρετε ένα πλήρες UV φάσμα. Κατωτέρω είναι 3 φάσματα παραδείγματος που όλα έχουν το αγαθό 260/280 αναλογίες, αλλά έχουν τις πολύ διαφορετικές αγνότητες. Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε την αναλογία 260/230 για να βοηθήσετε να καθορίσετε το ποσό οργανικής μόλυνσης στο RNA σας. Είναι ένας πιό μεταβλητός αριθμός από την αναλογία 260/280, αλλά γενικά, οι αναλογίες επάνω από 1 δείχνουν την καλή αγνότητα.

Ποσολόγηση της εξαγωγής και της απομόνωσης RNA

Απομόνωση RNA από τα υπομοριακά μέρη

Τα κύτταρα πλύθηκαν έπειτα σε PBS και εξήγαγαν διαδοχικά όπως περιγράφονται. Κατ' αρχάς, τα κύτταρα εξήχθησαν με το Nonidet π- 40 τον προσωρινό χώρο (mM τρης-CL 10, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v/v) Nonidet π- 40, 40 μονάδες/μιλ. Rnasin, 1 mM DTT). Ο υπόλοιπος σβόλος (τραχύ endoplasmic reticulum (RER) και πυρήνας) πλύθηκε στον ίδιο προσωρινό χώρο και εξήχθη στον προσωρινό χώρο β (mM τρης-CL 10 (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0,5% (v/$l*v) Nonidet π- 40, 40 mM EDTA, 40 μονάδες/μιλ. Rnasin, 1 mM DTT). Ο υπόλοιπος πυρηνικός σβόλος πλύθηκε στον ίδιο προσωρινό χώρο και εξήχθη με τον υψηλό αλατισμένο προσωρινό χώρο (mM τρης-CL 10 (pH 7.5), 0.5 μ NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v/$l*v) Nonidet π- 40, 40 μονάδες/μιλ. Rnasin, 1 mM DTT). Το RNA καθαρίστηκε από κάθε μέρος από τη λύση RNA STAT. Το συνολικό RNA ήταν απομονωμένο χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Rna- STAT60 (τηλ.-δοκιμή) σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχηκαν από τον κατασκευαστή. (Αναφορά: ψυεονγ-χωριάτης Jang et Al, 2002)

Απομόνωση RNA που χρησιμοποιεί το πρωτόκολλο CsCl

Προσωρινός χώρος χάους για την απομόνωση RNA

Για 100 mls 200 mls

4. θειοκυανικό άλας Guanidinium 53,2 γ 106,4 5M EDTA ν- Lauroylsarcosine 2% (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 0.5M 10 mls 20 mls 25mM τρης- HCl, pH 7,5 1M 2,5 mls 5 mls

0, β-μερθαπτοετχανολ 700ul 1.4mls 1M

0, ul 200 400 αντιαφρώδους ουσίας Α 2% (σίγμα) ul

5.,7 Τελική ένταση του ήχου μαξιλαριών μ CsCl * 100 μιλ.

5.,7 Μ "ψημένο" CsCl 95.8g

0, EDTA 1M 0.5M 20 mls

Διαδικασία εξαγωγής RNA που χρησιμοποιεί CsCl

* Αντιμετωπισμένο DEPC ύδωρ χρήσης και ψημένα γυαλικά. Αυτή η λύση, απολύτως, θετικά πρέπει να είναι rnase ελεύθερο. Rnase είναι παντοΰ Τα γάντια ένδυσης, χρήση έψησαν μόνο τα γυαλικά, ή το παρθένο πλαστικό. Τα DePC μεταχειρίζονται το ύδωρ σας, προσωρινοί χώροι (εκτός από Tris). Να είστε πολύ προσεκτικός.

1. Ζυγίστε ζωικός. Αφαιρέστε το όργανο (συκώτι), βάρος που μια από τις ανώτερες ιδιότητες DNA είναι εσείς μειώνει την πολυπλοκότητα γονιδίων με την επιλογή ενός οργάνου που εκφράζει μόνο έναν ενιαίο γεωμετρικό τόπο ενός ενζύμου multilocus. 2. Ομογενοποιήστε τον ιστό γρήγορα στον προσωρινό χώρο "χάουσ" (9mls) 3. Περιστρέψτε homogenant σε 12 κλ για να αφαιρέσετε το αδιάλυτο υλικό 4. ΕΝΩ Homogenant ΠΕΡΙΣΤΡΕΦΕΙ 4A. Βάρος έξω 1,8 γ CsCl (0.2g/mjl.) ανά δείγμα. 4B. Στο ultra-centrifuge σωλήνα ("γρήγορος-σφραγίδα") προσθέστε 3.5mls 5.7M CsCl "μαξιλάρι" που αυτό το στρώμα πρέπει να είναι rnase ελεύθερο. Θα υποβάλετε το RNA σας σε φυγοκέντρωση μέσω αυτού του στρώματος και οποιαδήποτε μόλυνση θα προκαλέσει τις σημαντικές απώλειες. 5. Αφαιρέστε supernant, βαλμένος στο φρέσκο σωλήνα, προσθέστε 1,8 γ CsCl 6. Προσεκτικά, προσθέστε homogenant πάνω από το μαξιλάρι CsCl. Αυτό ο ευκολότερα ολοκληρώνεται με τη χρησιμοποίηση μιας 10cc σύριγγας και μιας μακριάς βελόνας. Τοποθετήστε τη βελόνα/τη σύριγγα στο σωλήνα γρήγορος-σφραγίδων, και προσθέστε τον ιστό homogenant στη σύριγγα. Το Homogenant θα ρέει αργά αργά στο σωλήνα q-$l*s, που επιπλέει πάνω από το μαξιλάρι.

7. Προσεκτικά, αντιστοιχημένα ισορροπία ζευγάρια του σωλήνα φυγοκεντρωτών (+/- 0,005 γ).

8. Σωλήνες σφραγίδων, αντιστοιχημένοι θέση σωλήνες αντίθετοι ο ένας τον άλλον και της ΚΑΠ με τις κόκκινες κορυφές αργιλίου.

9. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση, 50.000 rpms 5,5 ώρες, 20oC

Μετά από τη φυγοκεντρικότητα: Σωλήνες σημαδιών όπου ο σβόλος πρέπει να είναι: από την κατώτατη εξωτερική πλευρά (σχετικά με το κέντρο του στροφέα)

10. Αφαιρέστε τους σωλήνες, τοποθετεί στο κατάλληλο ράφι.

11, Η φέτα από την κορυφή του σωλήνα απορροφά από κορυφαίο 2/3- 3/4 της λύσης. ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΚΟΡΥΦΗ ΚΑΤΩ. ΕΙΝΑΙ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ ΟΤΙ ΑΠΟΡΡΟΦΑΤΕ ΑΠΟ ΤΟΝ ΑΝΩΤΕΡΟ ΤΗΝ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΗ ΛΥΣΗ ΠΡΩΤΑ ΚΑΙ ΑΦΑΙΡΕΙΤΕ ΟΛΟ ΕΚΤΟΣ ΑΠΌ ΤΟ ΣΑΦΕΣ ΜΑΞΙΛΑΡΙ. ΜΗΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΤΕ ΤΟΝ ΑΟΡΑΤΟ ΣΒΟΛΟ ΣΤΟ ΚΑΤΩΤΑΤΟ ΣΗΜΕΊΟ.

12. Κόψτε το κορυφαίο 2/3 του σωλήνα. Χρησιμοποιώντας ένα "τργμένο" Pasteur εισάγετε στο σιφώνιο, αφαιρέστε προσεκτικά την παραμονή λύση. Ο σβόλος θα είναι στην κατώτατη πλευρά του σωλήνα.

13. Ξεπλύντε το σβόλο με 70% EtOH, αφαιρεί (η χρήση Pasteur εισάγει στο σιφώνιο), επαναλαμβάνει δύο φορές (συνολικά 3 πλυσίματα)

14. Προσθέστε το ul 200 0.1x TE (RNase ελεύθερο), η χρησιμοποίηση εισάγει στο σιφώνιο την άκρη για να συντρίψει το σβόλο και "τιτλοδότηση" T.E. της προσπάθειας να τεθεί ο σβόλος στη λύση. Τουλάχιστον διαμορφώστε μια ετερογενή λύση και βάλτε σε έναν φρέσκο σωλήνα microfuge.

15. Επαναλάβετε με το ul 200 T.E. συγκεντρώνοντας και τις δύο λύσεις

16. Η Δίνη, καλό RNA δεν επιθυμεί να πάει στη λύση. Η υπομονή είναι μια αρετή.

17. Καθορίστε τη συγκέντρωση, ul 10 στο ul 490 (500 τελικές εντάσεις ul)

18. Αφαιρέστε 1 έως 2 ug του RNA για την ανάλυση πηκτωμάτων (προσθέστε τους προσωρινούς χώρους φόρτωσης RNA)

19. Προσθέστε 1/10 rnase ελεύθερα 3M NaOAC έντασης του ήχου (ul 40), 2,5 εντάσεις του ήχου EtOH (1.0ml). Μίγμα σθεναρά.

20 Μπορείτε να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του RNA στα EtOH. Κατά συνέπεια, δεν υπάρχει καμία ανάγκη να κατακρημνιστεί το όλο RNA σας αμέσως. Ακριβώς αφαιρέστε περίπου 1,5 έως 2 φορές το ποσό που χρειάζεστε από EtOH/ti λύση RNA και αφαιρείτε την κατάλληλη ένταση του ήχου. Αυτό το EtOH/i λύση RNA που καταχωρείται σε 20oC ή χαμηλώνει, είναι σταθερά για χρόνια.

Δείτε: