Ο χορηγός/διαφημίζει & Σύνδεση με μας & Μας ελάτε σε επαφή με & Περίπου εμείς & Μας βοηθήστε

Η μοριακή βιολογία Blog

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Βόρειος λεκές

Πνευματικά δικαιώματα 2007 - μοριακός σταθμός

ΗΧΗΤΙΚΟΣ Ακούστε μια λεπτομερή βόρεια εξήγηση λεκέδων!

Ιστορία του βόρειου λεκιάσματος

Το βόρειο λέκιασμα είναι μια λεκιάζοντας τεχνική RNA που αναπτύχθηκε το 1977 από Alwine et το Al στο πανεπιστήμιο του Στάνφορντ (ref:1). Ονομάστηκε μετά από τη νότια τεχνική λεκέδων που λεκιάζει για το DNA, που εφευρίσκεται από τον Edwin M. Southern το 1975. Ο δυτικός λεκέσ, μια μέθοδος για για τις πρωτεϊ'νες είναι επίσης ένα παιχνίδι στη νότια ονομασία λεκέδων και ονομάστηκε το 1981 (ref:2).

Βασικές πληροφορίες - βόρεια τεχνική λεκέδων

Η βόρεια ανάλυση παρά την ηλικία της στον κόσμο υψηλής τεχνολογίας pcr πραγματικού χρόνου, δοκιμές προστασίας νουκλεάσης (RPAs) και microarrays, είναι ακόμα τα χρυσός-πρότυπα για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων mRNA. Αυτό είναι επειδή η βόρεια ανάλυση λεκέδων επιτρέπει μια άμεση σύγκριση της αφθονίας RNA αγγελιοφόρων μεταξύ των δειγμάτων σε μια ενιαία μεμβράνη.

Στο βόρειο λεκέ η βασική διαφορά μεταξύ των άλλων λεκιάζοντας τεχνικών είναι ότι το RNA είναι ο παράγοντας που ανιχνεύεται. Επίσης, λόγω στο γεγονός ότι το RNA είναι συνήθως single-stranded, δημιουργεί τις σύνθετες δευτεροβάθμιες δομές που έχουν επιπτώσεις στη μετανάστευσή της και ως εκ τούτου οι όροι μετουσίωσης χρησιμοποιούνται για να τρέξουν τα πηκτώματα (αντίθετα από νότιο).

Το RNA χωρίζεται έξω από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων RNA (συνήθως ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων αγαρόζης), την επόμενη μεταφορά στη μεμβράνη, την υβριδοποίηση με τον έλεγχο, και τελικά την ανίχνευση.

 

 

Ομοίως στο νότιο λέκιασμα, οι έλεγχοι υβριδοποίησης μπορούν να είναι DNA ή RNA στο βόρειο λέκιασμα.

Μια παραλλαγή της διαδικασίας γνωστής ως αντίστροφος βόρειος λεκές ήταν περιστασιακά (αν και, σπάνια) χρησιμοποιημένος. Σε αυτήν την διαδικασία, το νουκλεϊνικό οξύ υποστρωμάτων (ότι επισυνάπτεται στη μεμβράνη) είναι μια συλλογή των απομονωμένων τεμαχίων DNA, και ο έλεγχος είναι RNA που εξάγεται από έναν ιστό και επονομαζόμενο από ραδιενέργεια.

Η χρήση του DNA microarrays ότι έχει μπεί στη διαδεδομένη χρήση προς το τέλος της δεκαετίας του '90 και πρόωρου 2000s είναι πιό συγγενής στην αντίστροφη διαδικασία, δεδομένου ότι περιλαμβάνουν τη χρήση των απομονωμένων τεμαχίων DNA που επισυνάπτονται σε ένα υπόστρωμα, και την υβριδοποίηση με έναν έλεγχο που γίνεται από το κυψελοειδές RNA. Κατά συνέπεια η αντίστροφη διαδικασία, αν και αρχικά ασυνήθιστος, επέτρεψε στην ένας-$$$-Α-ΧΡΟΝΙΚΉ μελέτη της έκφρασης γονιδίων χρησιμοποιώντας τη βόρεια ανάλυση για να εξελιχθεί στη σκιαγράφηση έκφρασης γονιδίων, στην οποία πολλά (ενδεχομένως όλοι) από τα γονίδια σε έναν οργανισμό μπορούν να ελέγξουν την έκφρασή τους

Εφαρμογές του βόρειου λεκέ

Οι βόρειοι λεκέδες ήταν στις περισσότερες περιοχές από pcr πραγματικού χρόνου και τις microarray προσεγγίσεις. Δεν χρησιμοποιείται συχνά για κλινικούς ή διαγνωστικούς λόγους.

Το βόρειο πρωτόκολλο λεκέδων και οι παραλλαγές του χρησιμοποιούνται εντούτοις στη μοριακή έρευνα της βιολογίας:

• χρυσός-πρότυπα για την άμεση μελέτη της έκφρασης γονιδίων στο επίπεδο του mRNA (αντίγραφα RNA αγγελιοφόρων).
• ανίχνευση του μεγέθους αντιγράφων mRNA
• υποβάθμιση RNA μελέτης
• να συνδέσει RNA μελέτης - μπορεί να ανιχνεύσει τα εναλλακτικά συνδεμένα αντίγραφα
• μελετήστε την ημιζωή RNA
• ΟΡΓΕΣ μελέτης (εσωτερική ριβοσωματική περιοχή εισόδων) - για να αφαιρέσει τη δυνατότητα της πέψης RNA εναντίον της 2$ας μετάφρασης τμημάτων χρωμοσώματος.
• συχνά χρησιμοποιημένος για να επιβεβαιώσει και να ελέγξει τα διαγενετικά/knockout ποντίκια (ζώα)

Μειονεκτήματα του βόρειου λεκιάσματος

Τα μειονεκτήματα της χρησιμοποίησης του βόρειου λεκιάσματος περιλαμβάνουν:

• Συχνά η ραδιενέργεια χρησιμοποιείται. Αυτό αποτρέπει την ευκολία το, τη χρήση και τη διάθεση. Οι νέες μέθοδοι μη-ραδιενεργού ανίχνευσης έχουν παραχθεί επιτρέποντας την μη-ραδιενεργό ανίχνευση. Δείτε διαπερνά.
• Ολόκληρη η διαδικασία του βόρειου λεκιάσματος παίρνει έναν μακροχρόνιο χρόνο συνήθως, από την προετοιμασία δειγμάτων κατευθείαν στην ανίχνευση.
• Εάν τα δείγματα RNA ακόμη και ελαφρώς υποβιβάζονται από RNases, την ποιότητα των στοιχείων και του ποσοτικού προσδιορισμού της έκφρασης αρκετά έχουν δυσμενείς επιπτώσεις.
• Η πρότυπη βόρεια μέθοδος λεκέδων είναι σχετικά λιγότερο ευαίσθητη από τις δοκιμές προστασίας νουκλεάσης και το ρτ-πθρ. Η ευαισθησία των βόρειων λεκέδων μπορεί να αυξηθεί με τη χρήση θετικά- positively-charged των νάυλον μεμβρανών, χρήση ενός ιδιαίτερα συγκεκριμένου αντιαγγελιαφόρου ελέγχου.
• Η ανίχνευση με τους πολλαπλάσιους ελέγχους είναι ένα πρόβλημα. Συχνά, οι μεμβράνες πρέπει να γδυθούν πριν από την υβριδοποίηση και την ανίχνευση με έναν δεύτερο έλεγχο. Αυτό είναι ένα πρόβλημα όπως οι σκληροί όροι απαιτούνται στη λουρίδα από τους ελέγχους από το λεκέ και είναι επίσης χρονική κατανάλωση. Επίσης, υπάρχει ένα όριο στα χρονικά διαστήματα που ένας λεκές μπορεί να γδυθεί.

Πλεονεκτήματα του βόρειου λεκιάσματος

Τα πλεονεκτήματα των βόρειων λεκέδων περιλαμβάνουν:

• Είναι μια ευρέως αποδεκτή και καλά θεωρημένη μέθοδος
• το βόρειο λέκιασμα είναι μια απλή μέθοδος
• Συχνά χρησιμοποιείται ως επιβεβαίωση ή έλεγχος
• Συχνά χρυσός-πρότυπα
• είναι ένα ευπροσάρμοστο πρωτόκολλο δεδομένου ότι μπορεί να επιτρέψει τη χρήση πολλών τύπων ελέγχων (εναντίον pcr πραγματικού χρόνου) που περιλαμβάνουν: ραδιενεργά και μη-ραδιενεργά, in vitro μεταγραφόμενα RNA και ακόμη και oligonucleotides όπως οι εγχυτήρες.
• Οι ακολουθίες με ακόμη και τη μερική ομολογία, αντίθετα από pcr πραγματικού χρόνου ή άλλες μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως έλεγχοι υβριδοποίησης (δηλ. η ακολουθία από τα διαφορετικά είδη για την ανάλυση ομολογίας, ή ακόμα και τα genomic τεμάχια μπορεί να χρησιμοποιηθεί).

Βόρειο πρωτόκολλο λεκέδων

Όπως αναφέρεται τα βήματα στο βόρειο λέκιασμα περιλαμβάνουν:

1. Απομόνωση RNA
2. Ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων του RNA για το χωρισμό
3. Μεταφορά στη μεμβράνη (συνήθως που χρεώνεται θετικά το νάυλον ως RNA χρεώνεται αρνητικά)
4. Διασύνδεση του RNA στη μεμβράνη (συνήθως με Uv-crosslinking ή τα χημικά μέσα)
5. Υβριδοποίηση
6. Ανίχνευση

Υλικά που απαιτούνται για το βόρειο πρωτόκολλο λεκέδων

Συνταγές προσωρινών χώρων

20XSSPE (500 μιλ.)

• 3.6M NaCl: 105,2 γ
• 0, προσωρινός χώρος φωσφορικού άλατος 2M pH 7,0: 100mL 1M
• EDTA 20mM: 20mL 0.5M

Προσωρινός χώρος φωσφορικού άλατος pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL 1M
• Na2H2PO4 (διβασικά) 360 mL 1M
• το pH σε 7,0 και μετά από τους δύο προστίθεται

Προσωρινός χώρος υβριδοποίησης = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

 

* * Σωστός πρίν χρησιμοποιεί προσθέστε μετουσιωμένο το 1000ug ελεύθερο RNA ζύμης 5000ug DNA CT RNAse (θερμότητα 95o για 3 λ. για να μετουσιώσουν)

 

ΠΛΥΣΙΜΟ: 2X SSPE + 0,1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS = 0,1% SDS

Τρέχοντας προσωρινός χώρος για το πήκτωμα RNA (1L)

• 100 MOP mls 10X
• 52.,6 mls της φορμαλδεϋ'δης
• 847.,4 mls H20

Πήκτωμα RNA (70ml)

• 0,84 γ αγαρόζης
• 7 MOP mls 10x
• 58.38 mls H2O
• Τεθειμένο πήκτωμα στη λύση με τη θέρμανση. Αφήστε το πήκτωμα δροσερό σε 60°C, κατόπιν προσθέστε τη φορμαλδεϋ'δη σε ίσα 0.66M -- 3,78 mls
• Χύστε το πήκτωμα στην κουκούλα καπνών ει δυνατόν

Δείγματα RNA για το βόρειο λεκέ

Δείτε την απομόνωση και τον καθαρισμό RNA

Πήκτωμα RNA

Μετά από να απομονώσει το RNA, το RNA πρέπει να χωριστεί έξω σε ένα πήκτωμα (συνήθως αγαρόζη).

δείτε τα πηκτώματα RNA

Βόρεια μεταφορά λεκέδων στο νάυλον πρωτόκολλο μεμβρανών

Μετά από να τρέξει το πήκτωμα RNA, πλύντε το πήκτωμα με το αποσταγμένο νερό που τίθεται στο posiblotter.

Τα στρώματα από από πάνω έως κάτω είναι:

• σφουγγάρι
• 3-4 αποκοπή εγγράφων Whatman στο μέγεθος (και τα δύο επάνω ανωτέρω πρέπει να ενυδατωθούν σε 10X SSPE αλλά μη στάλαγμα)
• μάσκα πηκτωμάτων.
• Σημείωση: Σιγουρευτείτε τις επικαλύψεις πηκτωμάτων η μάσκα έτσι ώστε μπορεί να σφραγίσει τη μεμβράνη με τη γραμμή της κορυφής του πηκτώματος και η σωστή κορυφαία γωνία χαρακτήρισε 3 κομμάτια το ελαφρώς μεγαλύτερο σκληρό πλαστικό εγγράφου 3M με τις τρύπες

Ο σφιγκτήρας επάνω και σιγουρεύεται ότι υπάρχει μια καλή σφραγίδα. Χρησιμοποιήστε 75-80 χιλ. Hg της πίεσης για 1 ωρ. ή περισσότερους.

Λεκιάστε τη μεμβράνη ξηρά

Διασυνδέοντας τις νάυλον μεμβράνες - βόρειο πρωτόκολλο λεκέδων

• Κορυφαίο περικάλυμμα σωστών γωνιών αποκοπών saran στο περικάλυμμα.
• UV ακτινοβολήστε με την πλευρά RNA κάτω για 2,5 λ..
• Πλύσιμο για μερικά λεπτά στην καυτή 2X SSPE/0.1% λύση SDS (λύση μικροκυμάτων για 30-45 δευτερόλεπτα στη δύναμη 50%.
• Αέρας ξηρός

Προ υβριδοποίηση για το βόρειο λεκέ

1. Προ υβριδιοποιήστε για 6 ώρα-ολονύκτια
2. Θέστε το φούρνο στον προσωρινό χώρο HB θερμότητας 65°C για να βάλετε SDS στη λύση
3. Κυλήστε επάνω τη μεμβράνη μέσα στο κομμάτι του πλέγματος και βάλτε στο hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Έλεγχος για τις αεροφυσαλίδες
5. Τεθειμένος σωλήνας στο φούρνο που ισορροπείται με έναν άλλο σωλήνα στην αντίθετη πλευρά

Μαρκάρισμα του ελέγχου για το βόρειο λέκιασμα

1. Τεθειμένο 25ng του ελέγχου σε μια συνολική ένταση του ήχου 11uL με ddH2O
2. Μετουσιώστε @ 95°C 3 λ.. Αυτό πρόκειται να πάρει ενιαία προσαραγμένη ελέγχων και να αφαιρέσει τη δευτεροβάθμια δομή που θα απέτρεπε την αποδοτική υβριδοποίηση.
3. Γρήγορα δροσίστε στον υγρό πάγο. Αυτό πρόκειται να κρατήσει ενιαία προσαραγμένη ελέγχων, χωρίς δευτεροβάθμια δομή και να μην επιτρέψει (ή των δευτεροβάθμιων δομών).
4. Προσθέστε 4ul υψηλά πρωταρχικά (Boehringer Μανχάιμ) 5ul άλφα ραδιενεργά π- 32 dCTP 3000uCi/$l*mmole 20ul το σύνολο
5. Επωάστε 10-15 ελάχιστο 37°C
6. Προσθέστε 28uL 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, 20ul στην αντίδραση.
7. Προ-περιστροφή γ- 25 sephadex στήλη για 1 λεπτό.
8. Προσθέστε 50ul το δείγμα στη στήλη και την περιστροφή για 2,5 λ. στον κλινικό φυγοκεντρωτή. Αυτό πρόκειται να καθαρίσει τον έλεγχο μακρυά από την ετικέτα.
9. Ρίξτε μακριά τη στήλη.
10. Μίγμα σε ένα νέο RNA ζύμης CT-*DNA σωλήνων 100ug 50ug σε έναν σωλήνα 0.5mL.
11. Μετουσιώστε 95° 3 λ.
12. Προσθέστε στο υβριδικό μίγμα σωλήνων, υβριδιοποιήστε σε 65°C για 20-36 ώρες

Ταχυδρομήστε το πρωτόκολλο υβριδοποίησης για το βόρειο λέκιασμα

Υβριδιοποιήστε γιατί 36-48 ώρες κατόπιν πλένουν.

1. Θερμάνετε επάνω 2X SSPE/0.1% τη θερμότητα SDS (πλυσίματος) μέχρι 65° γ (μικρόκυμα χρήσης ή λουτρό ύδατος στη θερμή λύση)
2. Πάρτε έξω το σωλήνα και χύστε το υγρό στο καυτό εμπορευματοκιβώτιο ραδιενεργών αποβλήτων.
3. Το ξέβγαλμα με 10ml το πλύσιμο κάνει αυτό δύο φορές και χύνει τα απόβλητα έξω.
4. Τεθειμένος σε 40 έως 50 mls του πλυσίματος και του κουνήματος vigoursly.
5. Τεθειμένος στο φούρνο υβριδοποίησης για 20 λ. περιστροφής.
6. Χύστε κάτω από το νεροχύτη
7. Ένα άλλα 40-50mls και κούνημα στο φούρνο.
8. Χύστε έξω στο εμπορευματοκιβώτιο αποβλήτων (νεροχύτης εάν μη καυτός ή τοξικός) και σιγουρευτείτε ότι δεν είναι πλέον καυτό και πάρτε έπειτα έξω τη μεμβράνη.
9. Πλύσιμο στο δονητή με 0.2XSSPE W/$l*0,1% SDS rt για 15 λ..
10. Αέρας ξηρός
11. Εκθέστε

 

Ακρες για το βόρειο λεκέ

Εάν έχετε αυτήν την περίοδο μια συνιστώμενη μέθοδο για το RNA, συνεχίστε να την χρησιμοποιείτε.

Πάντα τρέξτε ένα πήκτωμα αγαρόζης του RNA σας για να αξιολογήσετε την ποιότητα. Όχι μόνο στηρίζεται στα αποτελέσματα φασματομετρίας.

* Χρησιμοποιήστε αντιμετωπισμένο το DEPC ύδωρ και τα ψημένα γυαλικά. Αυτή η λύση, απολύτως, θετικά πρέπει να είναι rnase ελεύθερο. Rnase είναι παντοΰ Τα γάντια ένδυσης, χρήση έψησαν μόνο τα γυαλικά, ή το παρθένο πλαστικό. Τα DePC μεταχειρίζονται το ύδωρ σας, προσωρινοί χώροι (εκτός από Tris). Να είστε πολύ προσεκτικός.

 

Ανιχνευώντας λάθη βόρειοι λεκέδες

Εάν έχετε αυτήν την περίοδο μια συνιστώμενη μέθοδο για το RNA, συνεχίστε να την χρησιμοποιείτε.

 

Συζητήστε και ταχυδρομήστε τις ερωτήσεις για αυτό στο βόρειο φόρουμ λεκέδων.

Βόρειες αναφορές λεκέδων

1. Alwine JC, Kemp DJ, άκαμπτη GR (1977). "Η μέθοδος για την ανίχνευση συγκεκριμένου RNAs στο αγαρόζη πήζει από τη μεταφορά στο δηαζοψενζυλοξυμετχυλ-χαρτί και την υβριδοποίηση με τους ελέγχους DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. ΗΠΑ 74 (12): 5350-4.
2. Θ*Ω. Θ*Νεαλ Burnette (Απρίλιος 1981). "" Δυτικό λέκιασμα ": η ηλεκτροφορητική μεταφορά των πρωτεϊνών από polyacrylamide dodecyl θειικού άλατος — νατρίου τα πηκτώματα χωρίς τροποποιήσεις nitrocellulose και η ακτινογραφική ανίχνευση με το αντίσωμα και το πρωτεϊνικό Α ". Πρωκτικό biochem 112 (2): 195-203.