Σε πραγματικό χρόνο PCR

Σε πραγματικό χρόνο PCR είναι ένας τύπος ποσοτικό PCR που μετρά το ποσό cDNA ή mRNA σε ένα δείγμα, είτε από έναν πληθυσμό των κυττάρων (ιστός ή κυτταροκαλλιέργεια), είτε πρόσφατα ακόμη και από ένα μονό κύτταρο. Ο πραγματικός χρόνος χρησιμοποιείται συνήθως για να καθορίσει την έκφραση mRNA ενός γονιδίου, και τα επίπεδα έκφρασής του (αριθμός αντιγράφων mRNA) κατά τη διάρκεια ορισμένων όρων (όπως η μεταχείρηση των κυττάρων με ένα φάρμακο).  Σε πραγματικό χρόνο PCR μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συγκρίνει τα κανονικά δείγματα (ελέγχου) με τα δείγματα ασθενειών, που δίνουν μια ιδέα ως προς τις αλλαγές έκφρασης που εμφανίζονται με την παθογένεση.  Σε πραγματικό χρόνο PCR λόγω της ευαισθησίας του χρησιμοποιείται επίσης στην ανίχνευση των παθογόνων στο αίμα όπως οι ιοί.

Η ανάπτυξη σε πραγματικό χρόνο ποσοτικό PCR έχει αποβάλει τη μεταβλητότητα που συνδέεται παραδοσιακά με ποσοτικό PCR, άδεια κατά συνέπεια
στερεότυπος και αξιόπιστος ποσοτικός προσδιορισμός PCR των προϊόντων.

Πίνακας περιεχομένων

Κάθε τύπος κυττάρων expressess ένα σύνολο mRNA μορίων, γνωστό ως transcriptome.  Σε απάντηση στα ερεθίσματα, τα κύτταρα είναι σε θέση να επάνω-ρυθμίσουν ή να κάτω-ρυθμίσουν τους παράγοντες όπως τα πρωτεϊνικά ένζυμα μέσα στο κύτταρο με τη ρύθμιση των mRNA επιπέδων αυτών των παραγόντων.  mRNA τα επίπεδα συσχετίζονται όχι πάντα με τα πρωτεϊνικά επίπεδα έτσι κάποια προσοχή είναι απαραίτητη, εντούτοις γενικά mRNA τα επίπεδα αόριστα αντιστοιχούν στα πρωτεϊνικά επίπεδα.  Η μέτρηση των mRNA επιπέδων ορισμένων παραγόντων μέσα σε ένα κύτταρο που χρησιμοποιεί σε πραγματικό χρόνο pcr είναι μια μέθοδος που θα δώσει τις ενδείξεις ως προς τις ποσότητες αυτών των παραγόντων ή πρωτεϊνών.

Παραδοσιακά, mRNA τα επίπεδα μέσα στο κύτταρο μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το βόρειο λέκιασμα.  Αυτή η τεχνική θεωρείται ως χρυσός-πρότυπα στη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων/mRNA δεδομένου ότι χρησιμοποιεί το ραδιενεργό έλεγχο για να ονομάσει το RNA, το οποίο ποσολογείται έπειτα χρησιμοποιώντας ένα σπινθηροβόλημα αντίθετο που δίνει τις πολύ ακριβείς αναγνώσεις. Το βόρειο λέκιασμα αν και πολύ ακριβής είχε διάφορα μειονεκτήματα συμπεριλαμβανομένης της χρήσης της ραδιενέργειας. Το βόρειο λέκιασμα απαίτησε την ακριβή μέτρηση mRNA και του συνολικού RNA από τα κύτταρα που εξήχθησαν προκειμένου να συγκριθούν τα δείγματα. Αυτό ήταν ένα πρόβλημα επειδή αν και οι μέθοδοι ανίχνευσης ήταν πολύ ακριβείς, το σφάλμα μπόρεσε να εισαχθεί στο βόρειο λέκιασμα (ή το σημείο RNA/την αυλάκωση που λεκιάζει) μέσω των διαφορών στα συνολικά επίπεδα RNA/mRNA μεταξύ των δειγμάτων (δηλ. θεραπείες κυττάρων, διαφορετικοί ιστοί, διαφορετικά ζώα, κ.λπ.).  Απαίτησε επίσης σχετικά το RNA μεγάλων ποσών που απαίτησε τους μεγάλους αριθμούς κυττάρων. Πρόσφατα, mRNA ο προσδιορισμός της ποσότητας γονιδίων ή οι σε πραγματικό χρόνο pcr μέθοδοι έχει βελτιωθεί και είναι ευκολότερος να εκτελέσει και δεν απαιτεί τη χρήση της ραδιενέργειας.  Οι ερευνητές συχνά μόνο έχουν πρόσβαση στα κύτταρα μικρών ποσοτήτων ειδικά στα πεδία της έρευνας κυττάρων μίσχων και της έρευνας αρχικών κυττάρων, και σε πραγματικό χρόνο pcr το έχει καταστήσει πιθανό να ποσολογήσει mRNA τα επίπεδα από ακόμη και τους πολύ μικρούς αριθμούς κυττάρων και πρόσφατα ακόμη και μονών κυττάρων.  Εντούτοις, αυτή η ακραία ευαισθησία των σε πραγματικό χρόνο pcr μεθόδων το καθιστά ζωτικής σημασίας να προστατεύσει τα δείγματά κάποιου από τη μόλυνση, η οποία θα οδηγούσε στα ψεύτικα αποτελέσματα. Οι παρούσες σε πραγματικό χρόνο pcr μέθοδοι και τα συστήματα επίσης δεν απαιτούν τη μέτρηση mRNA ή cDNA οι συγκεντρώσεις δειγμάτων πριν από σε πραγματικό χρόνο pcr διευθύνονται.

Το Higuchi et al.1, 2 καινοτόμησαν την ανάλυση PCR των κινητικών με την κατασκευή ενός συστήματος που ανιχνεύει PCR τα προϊόντα όπως
συσσωρεύουν. Αυτό το «σε πραγματικό χρόνο» σύστημα περιλαμβάνει το ethidium intercalator βρωμίδιο σε κάθε αντίδραση ενίσχυσης,
ένα προσαρμοσμένο θερμικό cycler για να ακτινοβολήσει τα δείγματα με το υπεριώδες φως, και ανίχνευση του προκύπτοντος φθορισμού
με μια με έλεγχο από υπολογιστή δροσισμένη φωτογραφική μηχανή CCD. Η ενίσχυση παράγει τα αυξανόμενα ποσά double-stranded
DNA, που δεσμεύει ethidium το βρωμίδιο, με συνέπεια μια αύξηση στο φθορισμό. Με τη χάραξη της αύξησης στο φθορισμό
εναντίον του αριθμού κύκλων, το σύστημα παράγει τις πλοκές ενίσχυσης που παρέχουν μια πληρέστερη εικόνα
PCR διαδικασία από να δοκιμάσει τη συσσώρευση προϊόντων μετά από έναν σταθερό αριθμό κύκλων.