2$α διαστατική ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων δύο

Η διαστατική ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων δύο (επίσης αποκαλούμενη βραχυνμένη ως 2$ο ηλεκτροφόρηση ή 2-de) είναι μια μέθοδος ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων που χρησιμοποιείται συνήθως για να χωρίσει ή να αναλύσει πολύ παρόμοιο στο μέγεθος, και επίσης πολλές πρωτεϊ'νες όπως το πλήρες σύνολο πρωτεϊνών παρουσών σε έναν δεδομένο χρόνο κυττάρων αμέσως, το proteome.

η 2$α ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων χωρίζει τις πρωτεϊ'νες σε δύο διαστάσεις, το ισοηλεκτρικές σημείο και τη μάζα. Αυτό επιτρέπει το χωρισμό των πρωτεϊνών που ειδάλλως δεν θα μπορούσε να χωριστεί ή να διακριθεί στα πηκτώματα 1-δ, συμπεριλαμβανομένων των ομοίως μεγέθους πρωτεϊνών και πολλών πρωτεϊνών (όπως ένα proteome).

2$ος πίνακας πηκτωμάτων του περιεχομένου

• 2$ο υπόβαθρο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων
• 2$α άρθρα πηκτωμάτων
• Χωρισμός από το ισοηλεκτρικό σημείο
• Διαστατική ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων δύο που λεκιάζει τις μεθόδους
• 2$ο πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων
• Αλλα 2$α πρωτόκολλα ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων
• Ανιχνευώντας λάθη 2$α πηκτώματα
• 2$ο φόρουμ ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων (μπορείτε να υποβάλετε οποιαδήποτε ερώτηση για το 2$ο εδώ! Επίσης ενώστε τον κατάλογο διευθύνσεων που λαμβάνει μέχρι τις ερωταποκρίσεις ημέρας στα 2$α πηκτώματα από άλλους ερευνητές και εμπειρογνώμονες επιστήμης!)

Διαστατικό υπόβαθρο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων δύο

Η ηλεκτροφόρηση όλων των κυψελοειδών πρωτεϊνών μέσω ενός σδς-πηκτώματος μπορεί να χωρίσει τις πρωτεϊ'νες που έχουν τις σχετικά μεγάλες διαφορές σε μοριακό βάρος εντούτοις, δεν μπορεί εύκολα να επιλύσει τις πρωτεϊ'νες που έχουν τα παρόμοια βάρη (π.χ. μια πρωτεϊ'νη 53-kDA από μια πρωτεϊ'νη 52-kDA).

Στη 1D μέθοδο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων, οι πρωτεϊ'νες είναι χωρισμένες σε μια διάσταση (ότι είναι αυτοί χωρίζεται από τη μάζα μόνο).

Στη 2$α ηλεκτροφόρηση, ο χωρισμός αρχίζει με την ηλεκτροφόρηση 1-δ εντούτοις υπάρχει ένας δεύτερος χωρισμός που πραγματοποιείται, χωρίζοντας τις πρωτεϊ'νες από τη δαπάνη σε μια κατεύθυνση 90 βαθμοί από τον πρώτο.

Το αποτέλεσμα είναι ότι τα κατάλοιπα διαδίδονται έξω πέρα από μια διαστατική επιφάνεια δύο μάλλον απ'ό,τι σύμφωνα με μια γραμμή. Κατά συνέπεια, λόγω στο γεγονός ότι οι πρωτεϊ'νες χωρίζονται από όχι μόνο τη μάζα αλλά και από τη δαπάνη, είναι απίθανο ότι θα υπάρξουν περισσότερες από μια πρωτεϊ'νες στο ένα δεδομένου του σημείου στο 2$ο πήκτωμα. Αυτό είναι επειδή είναι απίθανο ότι δύο πρωτεϊ'νες θα μοιράζονταν όχι μόνο την ίδια ακριβή μάζα αλλά και την ίδια δαπάνη.

Επομένως, σε ένα 2$ο πήκτωμα, τα κατάλοιπα χωρίζονται αποτελεσματικότερα στη 2$α ηλεκτροφόρηση από στην ηλεκτροφόρηση 1-δ που οφείλεται στο δεύτερο βήμα χωρισμού από τη δαπάνη.

Η 2$α μέθοδος χωρισμού πηκτωμάτων από το ισοηλεκτρικό σημείο

Προκειμένου να χωριστούν οι πρωτεϊ'νες μιας παρόμοιας μάζας, ένα άλλο φυσικό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών πρέπει να χρησιμοποιηθεί. Μια άλλη σημαντική φυσική πρωτεϊνική ιδιοκτησία που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο χωρισμό είναι ηλεκτρική δαπάνη, η οποία καθορίζεται από τον αριθμό όξινων και βασικών υπολειμμάτων σε μια πρωτεϊ'νη και τη δαπάνη ομάδας τους.

Δύο ανεξάρτητες πρωτεϊ'νες που έχουν τις παρόμοιες μάζες είναι απίθανο να έχουν τις ίδιες καθαρές δαπάνες επειδή η ακολουθία αμινοξέος τους θα ήταν διαφορετική, και έτσι η δαπάνη και ο αριθμός όξινων και βασικών υπολειμμάτων θα έδιναν μια διαφορετική καθαρή δαπάνη. Αυτό θα επέτρεπε σε αυτές τις πρωτεϊ'νες για να χωριστεί από το 2$ο, αλλά όχι από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων 1-δ.

Στη 2$α μέθοδο χωρισμού πηκτωμάτων, οι πρωτεϊ'νες χωρίζονται πραγματικά από το ισοηλεκτρικό σημείο (το ισοηλεκτρικό σημείο (pI) είναι το pH στο οποίο ένα ιδιαίτερη μόριο ή μια επιφάνεια δεν φέρνει καμία καθαρή ηλεκτρική δαπάνη).

Μια κλίση pH εφαρμόζεται σε ένα πήκτωμα και μια ηλεκτρική δυνατότητα εφαρμόζεται πέρα από το πήκτωμα, καθιστώντας ένα τέλος θετικότερο από άλλο. Σε όλο pHs aother από το ισοηλεκτρικό σημείο τους, οι πρωτεϊ'νες θα χρεωθούν. Εάν χρεώνονται θετικά, θα τραβούν προς το πιό αρνητικό τέλος του πηκτώματος και εάν χρεώνονται αρνητικά θα τραβούν στο θετικότερο τέλος του πηκτώματος. Μόλις φθάσουν στην περιοχή του πηκτώματος με το pH που αντιστοιχεί στο ισοηλεκτρικό σημείο τους, εντούτοις, θα γίνουν neutraly χρεωμένοι και θα παραμείνουν σε εκείνο το σημείο.

2$α ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων που λεκιάζει τις μεθόδους

Πρωτεϊνικά πρωτόκολλα ανίχνευσης για τη διαστατική ηλεκτροφόρηση δύο

Μετά από το χωρισμό, οι πρωτεϊ'νες είναι χωρισμένες έξω στο 2$ο πήκτωμα, εντούτοις είναι αόρατες στο γυμνό μάτι. Για να απεικονίσουν τις πρωτεϊ'νες στο πήκτωμα, οι πολύ ευαίσθητες μέθοδοι λεκιάσματος και ανίχνευσης των πρωτεϊνών πρέπει να πραγματοποιηθούν.

Αυτό οφείλεται σε διάφορα γεγονότα:

1. Οι πάροδοι πηκτωμάτων μπορούν μόνο να αποδεχθούν μια ορισμένη ένταση του ήχου του κυττάρου lysate ή της πρωτεϊνικής λύσης.
2. Αν και το lysate/i λύση μπορεί να κατακρημνιστεί και να συγκεντρωθεί για να φορτώσει περισσότερη πρωτεϊ'νη, συνήθως η λιγότερη πρωτεϊ'νη φορτώνεται στο 2D πήκτωμα δεδομένου ότι τα υπερβολικά πρωτεϊνικά ποσά το καθιστούν δύσκολο να αναλύσουν το πήκτωμα λόγω στα μεγάλα μεγέθη σημείων.
3. Ο χωρισμός μιας μεγάλης ποσότητας της πρωτεϊ'νης (mgs), ή ακόμα και χιλιάδες διαφορετικές πρωτεϊ'νες από μια μικρή πάροδο, σε ένα σχετικά μεγάλο πήκτωμα dimensionsional δύο παράγει τα σημεία των πρωτεϊνών που είναι πολύ χαμηλές abudance/sygke'ntrwsi (NG ή picograms!) που είναι αδύνατο ή δύσκολο να ανιχνευθεί με τους συνηθισμένους λεκέδες ή τις πρωτεϊνικές μεθόδους ανίχνευσης.
4. Μια χαμηλή αφθονία/μια χαμηλή πρωτεϊ'νη αριθμού αντιγράφων μπορεί να χωριστεί, αλλά δεν μπορεί να ανιχνευθεί ακόμη και λόγω στο γεγονός ότι οι πιό ευαίσθητοι λεκέδες έχουν μόνο ένα όριο ανίχνευσης περίπου ενός 1/2 ενός nanogram. Τα επίπεδα σημείων Picogram είναι αυτήν την περίοδο πολύ δύσκολο ή αδύνατο να ανιχνευθούν με το λέκιασμα.

2D στην ηλεκτροφόρηση, οι πολύ ευαίσθητοι λεκέδες επομένως απαιτούνται. Αυτές οι πρωτεϊ'νες μπορούν έπειτα να ανιχνευθούν με ποικίλα μέσα, αλλά ο πιό κοινός είναι ασημένιο λέκιασμα και coomasie λεκές.

Ασημένια λεκιάζοντας 2D πηκτώματα

Στο 2$ο ασήμι πηκτωμάτων που λεκιάζει, ένα ασημένιο κολλοειδές εφαρμόζεται στο πήκτωμα. Οι ασημένιοι δεσμοί cysteine στις ομάδες μέσα στην πρωτεϊ'νη. Το ασήμι έπειτα από την έκθεση στο UV φως. Το σκοτάδι του ασημιού στο σημείο, μπορεί να αφορά το ποσό ασημιού και επομένως η ποσότητα της πρωτεϊ'νης σε μια δεδομένη θέση στο πήκτωμα. Αυτή η μέτρηση μπορεί μόνο να δώσει τα κατά προσέγγιση ποσά, αλλά είναι επαρκής για τους περισσότερους λόγους.

Λέκιασμα Coomasie 2D των πηκτωμάτων

Η χρωστική ουσία Coomassie δεσμεύει στις πρωτεϊ'νες μέσω του physisorption στα αμινοξέα όπως τα αρωματικά αμινοξέα, arginine, και histidine. Το Coomasie χρησιμοποιείται επίσης στη μέθοδο του Μπράντφορντ. Οι ευαίσθητοι μη τοξικοί λεκέδες coomasie έχουν παραχθεί που επιτρέπουν την απεικόνιση των σημείων που περιέχουν λιγότερο από 1 NG της πρωτεϊ'νης.

Λέκιασμα SYPRO 2D των πηκτωμάτων

Το ΡΟΥΜΠΊΝΙ SYPRO είναι ένας πολύ ευαίσθητος 2D πρωτεϊνικός λεκές μεθόδου ανίχνευσης, επιτρέποντας την απεικόνιση περίπου του 1/2 ενός NG της πρωτεϊ'νης σε ένα δεδομένο σημείο. Το μειονέκτημα είναι η μέθοδος απαιτεί το UV φως για να απεικονίσει το λεκέ, απαιτώντας κατά συνέπεια τη χρήση ενός UV φωτός. Αυτό καθιστά την κοπή των σημείων δύσκολη και ενδεχομένως επικίνδυνη λόγω στην πιθανή UV έκθεση.

2$ο πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων

Ένα διαστατικό πρωτόκολλο ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων δύο για 7 IPG λουρίδων εκατ. αντίληψης Amersham Γερμανία.

2D προετοιμασία δειγμάτων πηκτωμάτων

• Τα πρωτεϊνικά δείγματα πρέπει συνήθως να είναι desalted ή διαλυμένα. Η διάλυση μπορεί να διευθυνθεί με τις μεγάλες τσάντες διάλυσης για τις μεγάλες εντάσεις του ήχου, ή μίνι διαφάνεια- (διαπερνήστε) για τις μικρές εντάσεις του ήχου.
• Η διάλυση διευθύνθηκε με 1 λ του διττανθρακικού άλατος αμμωνίου 0.3mM πάνω από 30 λεπτά χρησιμοποιώντας τις εξαρτήσεις μιας διαφάνεια- διάλυσης (διαπερνήστε).
• Μετά από τη διάλυση, τα δείγματα λυοφιλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας lyophilizer για 1 ½ ώρες.
• Τα λυοφιλοποιημένα δείγματα ανασυγκροτήθηκαν έπειτα με rehydration 400 λ τον προσωρινό χώρο.

Εστίαση IEF IsoElectric

Βήμα 1. rehydration των λουρίδων IPG

• Ο rehydration drystrip isoelectrofocusing δίσκος καθαρίστηκε προσεκτικά με τη λύση καθαρισμού IPGphor (Amersham Γερμανία που αισθάνεται).
• Σιγουρευτείτε ότι ο δίσκος είναι ξηρός μη υγρός, δεδομένου ότι το δείγμα θα μεταναστεύσει κατά μήκος των καναλιών ύδατος.
• Σιφώνιο 125 λ επάνω στην κυκλική περιοχή του δίσκου.
• Χρησιμοποιώντας τα τσιμπιδάκια, αφαιρέστε προσεκτικά τις λουρίδες IPG από τον πλαστικό προστάτη.
• Μερικές λουρίδες IPG έχουν έναν πλαστικό coversheet ή τη λουρίδα που προστατεύει την πλευρά πηκτωμάτων. Αφαιρέστε αυτό χρησιμοποιώντας τις λαβίδες/τα τσιμπιδάκια πρίν χρησιμοποιεί αυτές τις λουρίδες.
• Ήπια καθορίστε την πλευρά πηκτωμάτων λουρίδων κάτω επάνω στο δείγμα.
• Αφαιρέστε οποιεσδήποτε φυσαλίδες.
• Καθορίστε στο τέλος του ορυκτελαίου παρόδων δίσκων και σιγουρευτείτε ότι το ωθείτε κάτω από την πάροδο έως ότου καλύπτει εντελώς τη λουρίδα IPG. Σιγουρευτείτε τις επικαλύψεις ορυκτελαίου ολόκληρη η λουρίδα δεδομένου ότι αυτό αποτρέπει την εξάτμιση κατά τη διάρκεια των rehydration βημάτων.

"Οικία" Proteomics	Μοριακός σταθμός πρωτοκόλλων Proteomic	Πρωτόκολλα Proteomic (εξωτερικές συνδέσεις)	Βιοπληροφορική Proteomic	Proteomic FAQ	Εξαρτήσεις και προϊόντα Proteomic	Φόρουμ Proteomic	Proteomics Blog	Βιβλία σε Proteomics	Ειδήσεις Proteomic