Ο χορηγός/διαφημίζει & Σύνδεση με μας & Μας ελάτε σε επαφή με & Περίπου εμείς & Μας βοηθήστε

Η μοριακή βιολογία Blog

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Δείτε επίσης: Σχετικές συνδέσεις με τις εξωτερικές περιοχές: Δυτικός λεκές

Δυτικός λεκές

ΗΧΟΣ: Ακούστε μια λεπτομερή δυτική εξήγηση λεκέδων! Ευγένεια: Εθνικό ανθρώπινο ερευνητικό ίδρυμα γονιδιώματος.

Δυτικός καθορισμός λεκέδων: Το δυτικό λέκιασμα είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει και να εντοπίσει τις πρωτεϊ'νες βασισμένες στη δυνατότητά τους να δεσμεύσουν στα συγκεκριμένα αντισώματα.

   Η δυτική ανάλυση λεκέδων μπορεί να ανιχνεύσει την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας από ένα μίγμα ενός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών.  Το δυτικό λέκιασμα μπορεί να σας δώσει τις πληροφορίες για το μέγεθος της πρωτεϊ'νης σας (με τη σύγκριση σε έναν δείκτη ή μια σκάλα μεγέθους σε kDa), και να σας δώσει επίσης τις πληροφορίες για την πρωτεϊνική έκφραση (με τη σύγκριση σε έναν έλεγχο όπως το μη επεξεργασμένο δείγμα ή ένας άλλος τύπος ή ιστός κυττάρων). 

Περίληψη: Ο δυτικός λεκές σας δίνει τις πληροφορίες για:

Μέγεθος της πρωτεϊ'νης σας

Ποσότητα έκφρασης της πρωτεϊ'νης σας

Η δυτική ανάλυση λεκέδων μπορεί να αναλύσει οποιοδήποτε πρωτεϊνικό δείγμα είτε από τα κύτταρα είτε τους ιστούς, αλλά και μπορεί να αναλύσει τις ανασυνδυαζόμενες πρωτεϊ'νες που συντίθενται in vitro. Ο δυτικός λεκές εξαρτάται από την ποιότητα του αντισώματος που χρησιμοποιείτε για να εξετάσετε για την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας, και πόσο συγκεκριμένο είναι για αυτήν την πρωτεϊ'νη. Τα αντισώματα είναι τώρα εύκολα αποκτήσιμα από τις εμπορικές πηγές, και μπορείτε να αγοράσετε μιας για την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας. Εάν η πρωτεϊ'νη σας είναι μια νέα πρωτεϊ'νη, πρέπει να παραγάγετε ένα αντίσωμα οι ίδιοι ή να πάρετε μια επιχείρηση για να το κάνετε για σας. Σε αυτήν την περίπτωση θα χρειαστείτε τουλάχιστον μια μικρή ποσότητα της πρωτεϊ'νης σας είτε που καθαρίζεται από τα αποσπάσματα κυττάρων είτε που γίνεται ως ανασυνδυαζόμενη (δηλ. in vitro ή σε ένα ανασυνδυαζόμενο πρωτεϊνικό σύστημα έκφρασησ).   Τα αντισώματα συγκεκριμένα για την πρωτεϊ'νη σας είναι ζωτικής σημασίας στο δυτικό λέκιασμα δεδομένου ότι είναι σε θέση να δεσμεύσουν συγκεκριμένα στην πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας αντί χιλιάδων πρωτεϊ'νες στο δυτικό λεκέ σας!

Figure 1. Details των βημάτων που περιλαμβάνονται στη λήψη της πρωτεϊ'νης για το δυτικό λεκέ.

  Figure 2. Figure που απαριθμεί τα βήματα στη διεύθυνση ενός δυτικού λεκέ.

[Κορυφή]

Πώς το δυτικό λέκιασμα λειτουργεί;

Δείτε το διάγραμμα 1 κατωτέρω. Πρώτα πράγματα πρώτο. Λάβετε ένα πρωτεϊνικό δείγμα που θέλετε να αναλύσετε, όπως τα δείγματα κυττάρων. Lyse τα κύτταρα για να εκδώσετε το περιεχόμενο πρωτεϊ'νης. Τρέξτε αυτών σε ένα πήκτωμα που χωρίζει τις πρωτεϊ'νες βάσει του μεγέθους. Κατόπιν μεταφέρετε αυτές τις πρωτεϊ'νες πηκτωμάτων επάνω σε μια μεμβράνη χρησιμοποιώντας την ηλεκτρική ενέργεια. Αυτή η μεμβράνη μπορεί έπειτα να χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει για τις πρωτεϊ'νες ενδιαφέροντος χρησιμοποιώντας ένα αρχικό αντίσωμα.

Αυτό που χρειάζεστε στο δυτικό λεκέ:

Ένα πρωτεϊνικό δείγμα

Ένα καλό αντίσωμα για να ανιχνεύσει την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας

Ο δυτικός λεκές στηρίζεται στο αρχικό αντίσωμα για να ανιχνεύσει αυτήν την πρωτεϊ'νη από χιλιάδες πρωτεϊ'νες στη μεμβράνη σας και προηγουμένως στο πήκτωμά σας! (ένα κύτταρο μπορεί να περιέχει 30.000 διαφορετικές πρωτεϊ'νες - και αυτές τις ίδιες πρωτεϊ'νες μπορούν ακόμη και να αλλάξουν δίνοντας σας πάνω από 300.000 διαφορετικές πρωτεϊ'νες!). Η χρησιμοποίηση ενός αντισώματος αναγνωρίζει το αρχικό αντίσωμά ότι σας (ένα δευτεροβάθμιο αντίσωμα) εσείς ενισχύει ένα σάντουιτς πρωτεϊνικός-αντισωμάτων!  Το δευτεροβάθμιο αντίσωμα έχει ένα peroxidase ραδικιών αλόγων ένζυμο που μετατρέπει ένα υπόστρωμα luminol σε μια ελαφριά ουσία έκδοσης! Αυτό το φως ανιχνεύεται ως σημείο στην ταινία. Από αυτό το σημείο μπορείτε να καθορίσετε πόση πρωτεϊ'νη είναι εκεί σχετικά με άλλα σημεία, ή το μέγεθος της πρωτεϊ'νης σχετικά με έναν δείκτη μεγέθους που οργανώνεται επίσης στο πήκτωμα.

Το διάγραμμα 2 εμφανίζει δυτικό πήκτωμα παραδείγματος λεκέδων. Η πάροδος 1 είναι μια πρωτεϊνική σκάλα δεικτών μεγέθους που εμφανίζει διαφορετικά γνωστά μεγέθη των πρωτεϊνών, αυτό μπορεί να αγοραστεί εμπορικά και τα μεγέθη όλων των σημείων δίνονται σε ένα τεύχος. Η πάροδος 3 είναι ένα δείγμα καρκίνου και η πάροδος 5 είναι ένα κανονικό δείγμα. Όπως μπορείτε να δει την πρωτεϊ'νη στην πάροδο 3 έχει μια υψηλότερη έκφραση από το δείγμα καρκίνου στην πάροδο 5, η οποία είναι ενδιαφέρουσα. Επίσης, τα πρωτεϊνικά σημεία στις παρόδους 3 και 5 είναι το ίδιο μέγεθος με το 2$ο σημείο στη σκάλα μεγέθους από την πάροδο 1. Μπορούμε έπειτα να εξετάσουμε το γνωστό πρωτεϊνικό μέγεθος από το φυλλάδιό μας που λάβαμε με τη σκάλα. Έπειτα καθορίζουμε ότι το μέγεθος της πρωτεϊ'νης είναι 80 kDa. Η πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός μας είναι επίσης 80 kDa. Έτσι ξέρουμε ότι ο δυτικός λεκές ελειτούργησε και ότι η πρωτεϊ'νη εκφράζεται ιδιαίτερα σε ένα δείγμα καρκίνου!

Για να ανιχνεύσει την πρωτεϊ'νη σας:

Αγοράστε ένα αντίσωμα ενάντια στην αρχική πηγή αντισωμάτων σας

Χρησιμοποιήστε ένα ECL - chemiluminescence εξάρτηση και ταινία για να πάρετε τα αποτελέσματα

[Κορυφή]

Διάγραμμα 1.                                                                                                                                      Διάγραμμα 2.

Τώρα μάθετε ότι όλα τα άλλα είναι εκεί για τους δυτικούς λεκέδες!

[Κορυφή]

Πίνακας περιεχομένων, στην κατάταξη που γίνεται για το δυτικό λεκέ:

Βήματα στο δυτικό λέκιασμα:

- Προετοιμαμένος για το δυτικό λεκέ

- Ποιο αντίσωμα να χρησιμοποιήσει για τους δυτικούς λεκέδες

- Lysing τα κύτταρα για το δυτικό λεκέ

- Πληροφορίες πηκτωμάτων σδς-ΣΕΛΙΔΩΝ

- Προετοιμασία πηκτωμάτων σδς-ΣΕΛΙΔΩΝ για τους δυτικούς λεκέδες

- Ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων - που τρέχει το πήκτωμα

- Tranfer των πρωτεϊνών στη μεμβράνη για το δυτικό λέκιασμα

- Δυτικός λεκές

Όροι και ορισμοί που χρησιμοποιούνται στη δυτική ανάλυση λεκέδων

Πιό πρόσφατα δυτικά θέματα λεκέδων!

 

[Κορυφή]

Βήματα στη δυτική ανάλυση λεκέδων:

- Δείγμα Prepartation

- Lysing ο προσωρινός χώρος

- Αντίσωμα

- Lysing τα κύτταρα

- Προετοιμασία πηκτωμάτων

- Τρέχοντας πήκτωμα

- Μεταφορά του πηκτώματος

- Έλεγχοι

- Δυτικός λεκές

- Ανάγνωση

- Ανάλυση και ερμηνεία

[Κορυφή]

Για να προετοιμάσει τα δείγματα για το δυτικό λεκέ:

Εάν έχετε τα μη-προσκολλημένα κύτταρα (όπως οι με κύτταρο Τ γραμμές ή τα απομακρυσμένα κύτταρα αίματος) ή τα προσκολλημένα κύτταρα (όπως τα κύτταρα ινοβλάστεων ή τα κύτταρα ΜΑΡΟΥΛΙΩΝ), πρέπει να αφαιρέσετε τις ξένες πρωτεϊ'νες από τα μέσα. Για τα μη-προσκολλημένα κύτταρα μπορείτε ήπια να τους κοκκοποιήσετε με τη φυγοκεντρικότητα και να πλύνετε έπειτα το σβόλο με PBS. Για τα προσκολλημένα κύτταρα, το απλό πλύσιμο η φιάλη ή το πιάτο με PBS πριν από το δυτικό λεκέ.

 

Η δυτική ανάλυση λεκέδων εξετάζει τις πρωτεϊ'νες, και έτσι θέλουμε τις πρωτεϊ'νες για να είμαστε έκδοση από τα κύτταρα και να αποτρέψουμε επίσης τις πρωτεϊ'νες από να κοπούμε επάνω από τις πρωτεάσεις. Χρειαζόμαστε αυτοί στο δυτικό λεκέ:

- για να κρατήσει το κρύο πραγμάτων! 4C στον πάγο κατά τη διάρκεια της λύσης κυττάρων για το δυτικό λέκιασμα

- απορρυπαντικό χρήσης για να χωρίσει τις μεμβράνες των κυττάρων για να εκδώσει τις πρωτεϊ'νες

- Προσωρινός χώρος

- Ανασταλτικοί παράγοντες (και ανασταλτικοί παράγοντες πρωτεάσεων και ανασταλτικοί παράγοντες φωσφατάσεων εάν θα κάνουμε το δυτικό λεκέ για phospho-proteins)

 

Απορρυπαντικό - lysing τα κύτταρα για το δυτικό λεκέ

SDS και RIPA είναι απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται για να διαλυτοποιήσουν τις πρωτεϊ'νες για την πιό πρόσφατη ανάλυση χρησιμοποιώντας το δυτικό λέκιασμα. Αυτό απαιτείται δεδομένου ότι πολλές πρωτεϊ'νες είναι είτε μέσα στο κύτταρο είτε τις τοποθετημένες εσωτερικές μεμβράνες κυττάρων, έτσι πρέπει να εκδώσουμε αυτές τις πρωτεϊ'νες για να είμαστε σε θέση στο immunoblot για τις.

[Κορυφή]

Ποιο αντίσωμα θα έπρεπε να χρησιμοποιήσω για το δυτικό λέκιασμα;

Πρέπει να επιλέξετε ένα αντίσωμα που χρησιμοποιεί για το δυτικό λεκέ. Συνήθως είτε τα μονοκλονικά αντισώματα ποντικιών είτε τα polyclonal αντισώματα κουνελιών χρησιμοποιούνται.

Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε είτε ένα αντίσωμα χωρίς οποιεσδήποτε προστιθέμενες ομάδες, είτε να χρησιμοποιήσετε ένα αντίσωμα που κλίνεται biotin. Αυτά τα αντισώματα δεν απαιτούν

 

Polyclonal εναντίον των μονοκλονικών αντισωμάτων για το δυτικό λεκέ

Τα μονοκλονικά αντισώματα είναι συνήθως καλύτερα για το δυτικό λέκιασμα λόγω:

- καλύτερη αναλογία σήματος/διαταραχή (χαμηλότερο υπόβαθρο στο δυτικό λεκέ)

- η υψηλότερη ιδιομορφία τους (παίρνετε λιγότερων που μολύνουν τις πρωτεϊ'νες ή Ig)

- γενικά καθαρότερα αποτελέσματα για τη δυτική λεκιάζοντας ταινία (λιγότερες μη συγκεκριμένες ζώνες που ανιχνεύονται)

 

Τα polyclonal αντισώματα είναι καλύτερα ταιριαγμένα για immunoprecipitation:

- αναγνωρίζουν περισσότερα επίτοπα

- έχει την υψηλότερη πλεονεξία

[Κορυφή]

Lysing τα κύτταρα για το δυτικό λεκέ:

ΑΚΡΕΣ προτού lyse για το δυτικό λέκιασμα:

Εάν πηγαίνετε στο δυτικό λεκέ για την πρωτεϊνική μάζα (δηλ. μια πρωτεϊ'νη που δεν είναι phosphorylated):

- μπορείτε lyse στις μεγαλύτερες εντάσεις του ήχου (που κρατούν το υπόλοιπο που λεκιάζει για άλλες πρωτεϊ'νες)

 

Εάν πηγαίνετε στο δυτικό λεκέ phospho-protein (ή phosphorylated πρωτεϊ'νη) είναι σημαντικό να γίνουν τα εξής:

- σιγουρευτείτε εσείς χρησιμοποιεί τους ανασταλτικούς παράγοντες φωσφατάσεων (όπως το vanadate επειδή οι φωσφατάσεις θα αφαιρέσουν τα φωσφορικά άλατα από τις πρωτεϊ'νες σας! )

- επίσης lyse τα κύτταρα στη μικρότερη ένταση του ήχου πιθανή (δηλ. lyse στον προσωρινό χώρο φόρτωσης 100 ul, αυτό γίνεται επειδή μπορείτε να φορτώσετε των περισσότερων από τα κύτταρα που lysed. Αυτό είναι σημαντικό δεδομένου ότι το σήμα είναι αρκετά αδύνατο κατά το δυτικό λέκιασμα για phospho-proteins.)

 

Εάν εξετάζετε τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεισ:

- μην χρησιμοποιήστε SDS δεδομένου ότι χωρίζει τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και έτσι οι πρωτεϊ'νες μετουσιώνονται (ειδικά μετά από να βράσει)

- για τις δυτικές λεκιάζοντας πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, δηλ. οι εγγενείς αλληλεπιδράσεις εσείς πρέπει να χρησιμοποιήσουν ένα λιγότερο-αυστηρό απορρυπαντικό τέτοιο RIPA.

 

Lysing:

- μπορεί να γίνει άμεσα στο πιάτο ή το πιάτο

- κοκκοποιήστε τα κύτταρα

- Κρατήστε στον πάγο και το κρύο - χρησιμοποιήστε έναν κάδο πάγου

- Εμπειροτεχνική μέθοδος για πόση λύση ο προσωρινός χώρος στη χρήση είναι: 10^5 κύτταρα/uL του προσωρινού χώρου λύσης

- συλλέξτε στους σωλήνες και την ετικέτα eppendorf (κρατήστε αυτών στον πάγο)

 

Μετρήστε τη συνολική πρωτεϊ'νη πριν από τη δυτική ανάλυση λεκέδων:

- αυτό επιτρέπει περισσότερη ποσοτική ανάλυση εάν θέλετε να συγκρίνετε τους όρους επεξεργασίας στη δυτική ανάλυση λεκέδων

- οι εμπορικές εξαρτήσεις είναι διαθέσιμες όπως μια δοκιμή του Μπράντφορντ για τη μέτρηση της συνολικής πρωτεϊ'νης (από το βιο-RAD)

- 0,1% SDS ή μεγαλύτερος μπορεί να παρεμποδίσει την πρωτεϊνική μέτρηση

 

Μετουσιώστε τα πρωτεϊνικά δείγματα:

- προσθέστε τον πρωτεϊνικό προσωρινό χώρο δειγμάτων φόρτωσης σε ένα υποπολλαπλάσιο του κυττάρου lysate - περιέχει τη χρωστική ουσία (επίσης δείτε τη μετανάστευση σε ένα πήκτωμα, 2% SDS)

- προσθέστε το μειώνοντας πράκτορα δισουλφιδίου τέτοιοι ως βήτα - mercaptoethanol

- Βράστε στο λουτρό ύδατος ή την ομάδα δεδομένων θέρμανσης (χαμηλότερες θερμοκρασίες όπως μέσος - 90 βαθμοί μειώνουν την πρωτεϊνική συνάθροιση).

- Σπρώξτε μια τρύπα στην ΚΑΠ κάθε σωλήνα για να αποτρέψετε το σκάσιμο

 

Σδς-ΣΕΛΙΔΑ πληροφορίες πηκτωμάτων για το δυτικό λέκιασμα

Σδς-ΣΕΛΙΔΑ τα πηκτώματα είναι μήτρες πηκτωμάτων που χρησιμοποιούνται στις χωριστές πρωτεϊ'νες από το μέγεθος παρουσία του ηλεκτρικού ρεύματος. Το χαμηλό ποσοστό πήζει τις χωριστές μεγαλύτερες πρωτεϊ'νες ενώ το υψηλότερο ποσοστό πήζει τις χωριστές μικρότερες πρωτεϊ'νες καλύτερα. Το πρόβλημα είναι ότι όλες οι πρωτεϊ'νες έχουν χρεωμένη συνδεμένος με τους, και σε ένα ηλεκτρικό ρεύμα αυτό θα μπορούσε να προκαλέσει τα προβλήματα. Αυτό λύνεται από την προσθήκη SDS στα πρωτεϊνικά δείγματα. SDS δεσμεύει στις πρωτεϊ'νες κάθε λίγα αμινοξέα και εξουδετερώνει τις διαφορές δαπανών που οι πρωτεϊ'νες έχουν. Αυτό επιτρέπει στις πρωτεϊ'νες για να χωριστεί από το μέγεθος και όχι από τη δαπάνη.

[Κορυφή]

Σδς-ΣΕΛΙΔΑ προετοιμασία πηκτωμάτων για το δυτικό λεκέ

- ανάλογα με πόση πρωτεϊ'νη θα θελήσετε να φορτώσετε για το δυτικό λέκιασμα, πρέπει να χρησιμοποιήσετε τις μικρές χτένες ή τις μεγαλύτερες χτένες.

- το ποσοστό της ακρυλαμίδης είναι σημαντικό. Συνήθως η ακρυλαμίδη 10% χρησιμοποιείται.

- Ένα πήκτωμα επίλυσης χρησιμοποιείται στο κατώτατο σημείο με ένα pH 8,8

- Ένα πήκτωμα (45%) pH 6,8 συσσώρευσης χρησιμοποιείται για να συσκευάσει τις πρωτεϊ'νες μέσα μαζί μετά από τη φόρτωση

- Ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων αυξάνεται από τους καταλύτες aps και TEMED που επιταχύνουν την αντίδραση πολυμερισμού (σχηματισμός και στερεοποίηση) του poly-acrylamide πηκτώματος.

- Φορτώστε κάθε δείγμα προσεκτικά και αργά για να αποτρέψετε το δείγμα από την πάροδο.

- Φορτώστε κάθε πάροδο και προσωρινό χώρο δειγμάτων χρήσης σε κάθε ένας (για να αποτρέψει τις διαφορές μέσα).

[Κορυφή]

Πήξτε την ηλεκτροφόρηση

1. Υποβάλτε τα δείγματα σε φυγοκέντρωση για 10 SEC μετά από να βράσει.
2. Φορτώστε το δείγμα σε κάθε πάροδο
3. Φορτώστε την αναφορά MW
4. Τρέξτε το πήκτωμα σε 100V (σταθερή τάση) ή ακόμα και καλύτερος σε 40 mA (σταθερό ρεύμα). Προσέξτε το πρωτεϊνικό μέτωπο δεικτών/σκαλών ή χρωστικών ουσιών για πότε για να σταματήσει το πήκτωμα. Το σταθερό ρεύμα δίνει τα καλύτερα και αιχμηρότερα αποτελέσματα εάν έχετε το χρόνο.

- ρολόι για τις φυσαλίδες μεταξύ του γυαλιού και κάτω από το πήκτωμα - αυτό σημαίνει ότι λειτουργεί

- προσέξτε για την πρωτεϊνική μετανάστευση (πρέπει να πάει κάτω) - εάν όχι έχετε μεταστρέψει τους μολύβδους και μπορείτε να χάσετε όλα τα δείγματά σας!

- Αρχικά τρέξτε αργά μέσω του πηκτώματος (~ συσσώρευσης 50 βολτ), αυτό δίνει τις αιχμηρότερες ζώνες.

- Μην τρέξτε ολονυκτίς

- Μην υπερθερμάνετε το πήκτωμα (αυτό αναγκάζει το πήκτωμα για να χάσει την ακαμψία, που οδηγεί φτωχό και τις μουτζουρωμένες άσχημα διαμορφωμένες ζώνες)

[Κορυφή]

Tranfer των πρωτεϊνών στη μεμβράνη για το δυτικό λέκιασμα

Επιλέξτε τον τύπο μεμβρανών:

Μπορέστε να χρησιμοποιήσει καθένας:

- Μεμβράνη PVDF για τους δυτικούς λεκέδες

- Nitrocellulose μεμβράνη για τους δυτικούς λεκέδες

- Νάυλον μεμβράνη (σπάνια χρησιμοποιούμενη τώρα - μπορεί να σχίσει)

 

Ακρες για τη μεταφορά στη δυτική μεμβράνη:

- Γάντια ένδυσης πάντα! Λαβίδες χρήσης

- Ελαχιστοποιήστε σχετικά με/λαβίδες στη μεμβράνη

 

Βιο-RAD κατάταξη μεταφοράς:

()
σφουγγάρι στο Μαύρο
έγγραφο φίλτρων
nitrocellulose πηκτωμάτων
έγγραφο φίλτρων
σφουγγάρι
(+)

Μεταφορά :

- Κρατήστε δροσερός 4C

- Μεταφορά ολονυκτίς σε 35 Β

- Μπορεί να μεταφέρει γρήγορα σε 1 ώρα στο υψηλότερο Β

[Κορυφή]

Δυτικός λεκές

Το φράξιμο μεμβρανών επιτρέπει σε σας για να μεγιστοποιήσει την αναλογία signal:noise

- γάντια ένδυσης

- Ομάδα δεδομένων με 5% blotto (non-fat ξηρό γάλα - σκόνη) ή 1 - 5% BSA (λευκωματίνη βοοειδών ορών) για τις phosphorylated πρωτεϊ'νες.

- Ο προσωρινός χώρος είναι TBST

Πλύσιμο μετά από να εμποδίσει

- η πλύση μετά από να εμποδίσει τα βήματα δεν είναι κρίσιμη, ως ομάδα δεδομένων ανθρώπων συχνά κατά τη διάρκεια των αρχικών επωάσεων αντισωμάτων.

- η πλύση γίνεται συνήθως με τον προσωρινό χώρο TBST. Μπορέστε να γίνετε γρήγορα με μια μεγάλη ένταση του ήχου TBST.

Επώαση με το αρχικό αντίσωμα

- ποντίκι, κουνέλι ή άλλα είδη

- συνήθως 1: διάλυση 1000 με TBST

- εάν το υψηλό υπόβαθρο/πολλές μη συγκεκριμένες ζώνες είναι ένα πρόβλημα, οι επωάσεις μπορούν να γίνουν με 5% BSA ή γάλα.

Πλύσιμο μετά από το αρχικό αντίσωμα

- όχι τόσο κρίσιμος

- μπορεί να πλύνει γρήγορα με τις μεγάλες εντάσεις του ήχου TBST

Επώαση του δευτεροβάθμιου αντισώματος

- συνήθως αραιωμένο 1: 10, 000 με TBST

- αντι-ποντίκι, αντι-κουνέλι, ή άλλο αντίσωμα που κλίνεται με το ένζυμο HRP για την ανίχνευση

Πλύσιμο μετά από το δευτεροβάθμιο αντίσωμα

- ΚΡΙΣΙΜΟΣ

- Πλύσιμο 5 Χ για 5 λεπτά με TBST.

- Εάν πρέπει πραγματικά να ορμήξετε, πλύντε τουλάχιστον 3 φορές με τις μεγαλύτερες εντάσεις του ήχου TBST.

Να δοκιμάσει για τα αποτελέσματα

- συνήθως ECL (ενισχυμένο chemiluminescence) χρησιμοποιείται

- η ταινία εκτίθεται και αναπτύσσεται. Η έκθεση για 10 δευτερόλεπτα είναι αρκετά συνήθως για τη συνολική πρωτεϊ'νη. Phospho-proteins μπορούν να απαιτήσουν 2 - 20 μικρές εκθέσεις.

- η ταινία είναι συνήθως XOMAT ή παρόμοια "γρήγορη" ταινία

[Κορυφή]

Δείτε το δυτικό λεκέ ανίχνευσης λαθών

Οι όροι χρησιμοποίησαν στο δυτικό λέκιασμα:

WB - δυτικός λεκές

IB - immunoblot (ένας άλλος όρος για το δυτικό λέκιασμα)

SDS - dodecyl θειικό άλας νατρίου (ένα απορρυπαντικό που χρησιμοποιείται σε πολλές δυτικές λεκιάζοντας λύσεις)

ΣΕΛΙΔΑ - ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων Polyacrilamide

Αβ - αντίσωμα (τα αντισώματα χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας)

HRP - peroxidase ραδικιών αλόγων

Luminol - υπόστρωμα που HRP διασπά για να προκαλέσει τον ελαφρύ σχηματισμό

ECL - ενισχυμένο chemiluminescence (δυτική λύση λεκέδων που ενισχύει τον ελαφρύ σχηματισμό από HRP + Luminol)

kD/$l*kDa - kilodalton (ο περισσότερος μέσος όρος πρωτεϊνών μεταξύ 30 - 80 kDa)

RAM - αντι-ποντίκι Ig κουνελιών

Ig - isotype αντισωμάτων Immunoglobulin(an)

NP- 40 - Nonidet π- 40

PMSF - φθορίδιο phenylmethylsulfonyl

BSA - λευκωματίνη βοοειδών ορών

NFDM - non-fat ξηρό γάλα

[Κορυφή]

[Κορυφή]