Δυτικός λεκές

Τώρα μάθετε ότι όλα τα άλλα είναι εκεί για τους δυτικούς λεκέδες!

- Δείγμα Prepartation

- Lysing ο προσωρινός χώρος

- Αντίσωμα

- Lysing τα κύτταρα

- Προετοιμασία πηκτωμάτων

- Τρέχοντας πήκτωμα

- Μεταφορά του πηκτώματος

- Έλεγχοι

- Δυτικός λεκές

- Ανάγνωση

- Ανάλυση και ερμηνεία

Εάν έχετε τα μη-προσκολλημένα κύτταρα (όπως οι με κύτταρο Τ γραμμές ή τα περιφερειακά κύτταρα αίματος) ή τα προσκολλημένα κύτταρα (όπως τα κύτταρα ινοβλάστεων ή τα κύτταρα ΜΑΡΟΥΛΙΩΝ), πρέπει να αφαιρέσετε τις ξένες πρωτεΐνες από τα μέσα. Για τα μη-προσκολλημένα κύτταρα μπορείτε ήπια να τους κοκκοποιήσετε με τη φυγοκεντρικότητα και να πλύνετε έπειτα το σβόλο με PBS. Για τα προσκολλημένα κύτταρα, το απλό πλύσιμο η φιάλη ή το πιάτο με PBS πριν από το δυτικό λεκέ.

Η δυτική ανάλυση λεκέδων εξετάζει τις πρωτεΐνες, και έτσι θέλουμε τις πρωτεΐνες για να είμαστε έκδοση από τα κύτταρα και να αποτρέψουμε επίσης τις πρωτεΐνες από να κοπούμε επάνω από τις πρωτεάσεις. Χρειαζόμαστε αυτοί στο δυτικό λεκέ:

- για να κρατήσει το κρύο πραγμάτων! 4C στον πάγο κατά τη διάρκεια της λύσης κυττάρων για το δυτικό λέκιασμα

- απορρυπαντικό χρήσης για να χωρίσει τις μεμβράνες των κυττάρων για να εκδώσει τις πρωτεΐνες

- Προσωρινός χώρος

- Ανασταλτικοί παράγοντες (και ανασταλτικοί παράγοντες πρωτεάσεων και ανασταλτικοί παράγοντες φωσφατάσεων εάν θα κάνουμε το δυτικό λεκέ για phospho-proteins)

Απορρυπαντικό - Lysing τα κύτταρα για το δυτικό λεκέ

SDS και RIPA είναι απορρυπαντικά που χρησιμοποιούνται για να διαλυτοποιήσουν τις πρωτεΐνες για την πιό πρόσφατη ανάλυση χρησιμοποιώντας το δυτικό λέκιασμα. Αυτό απαιτείται δεδομένου ότι πολλές πρωτεΐνες είναι είτε μέσα στο κύτταρο είτε τις τοποθετημένες εσωτερικές μεμβράνες κυττάρων, έτσι πρέπει να εκδώσουμε αυτές τις πρωτεΐνες για να είμαστε σε θέση στο immunoblot για τις.

Πρέπει να επιλέξετε ένα αντίσωμα που χρησιμοποιεί για το δυτικό λεκέ. Συνήθως είτε τα μονοκλονικά αντισώματα ποντικιών είτε τα polyclonal αντισώματα κουνελιών χρησιμοποιούνται.

Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε είτε ένα αντίσωμα χωρίς οποιεσδήποτε προστιθέμενες ομάδες, είτε να χρησιμοποιήσετε ένα αντίσωμα που κλίνεται biotin. Αυτά τα αντισώματα δεν απαιτούν

Polyclonal εναντίον των μονοκλονικών αντισωμάτων για το δυτικό λεκέ

Τα μονοκλονικά αντισώματα είναι συνήθως καλύτερα για το δυτικό λέκιασμα λόγω:

- καλύτερη αναλογία σήματος/διαταραχή (χαμηλότερο υπόβαθρο στο δυτικό λεκέ)

- η υψηλότερη ιδιομορφία τους (παίρνετε λιγότερων που μολύνουν τις πρωτεΐνες ή Ig)

- γενικά καθαρότερα αποτελέσματα για τη δυτική λεκιάζοντας ταινία (λιγότερες μη συγκεκριμένες ζώνες που ανιχνεύονται)

Τα Polyclonal αντισώματα είναι καλύτερα ταιριαγμένα για Immunoprecipitation:

- αναγνωρίζουν περισσότερα επίτοπα

- έχει την υψηλότερη πλεονεξία

ΑΚΡΕΣ προτού lyse για το δυτικό λέκιασμα:

Εάν πηγαίνετε στο δυτικό λεκέ για την πρωτεϊνική μάζα (δηλ. μια πρωτεΐνη που δεν είναι phosphorylated):

- μπορείτε lyse στις μεγαλύτερες εντάσεις του ήχου (που κρατούν το υπόλοιπο που λεκιάζει για άλλες πρωτεΐνες)

Εάν πηγαίνετε στο δυτικό λεκέ phospho-protein (ή phosphorylated πρωτεΐνη) είναι σημαντικό να γίνουν τα εξής:

- σιγουρευτείτε εσείς χρησιμοποιεί τους ανασταλτικούς παράγοντες φωσφατάσεων (όπως το vanadate επειδή οι φωσφατάσεις θα αφαιρέσουν τα φωσφορικά άλατα από τις πρωτεΐνες σας! )

- επίσης lyse τα κύτταρα στη μικρότερη ένταση του ήχου πιθανή (δηλ. lyse στον προσωρινό χώρο φόρτωσης 100 ul, αυτό γίνεται επειδή μπορείτε να φορτώσετε των περισσότερων από τα κύτταρα που lysed. Αυτό είναι σημαντικό δεδομένου ότι το σήμα είναι αρκετά αδύνατο κατά το δυτικό λέκιασμα για phospho-proteins.)

Εάν εξετάζετε τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις:

- μην χρησιμοποιήστε SDS δεδομένου ότι χωρίζει τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις και έτσι οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται (ειδικά μετά από να βράσει)

- για τις δυτικές λεκιάζοντας πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, δηλ. οι εγγενείς αλληλεπιδράσεις εσείς πρέπει να χρησιμοποιήσουν ένα λιγότερο-αυστηρό απορρυπαντικό τέτοιο RIPA.

Lysing:

- μπορεί να γίνει άμεσα στο πιάτο ή το πιάτο

- κοκκοποιήστε τα κύτταρα

- Κρατήστε στον πάγο και το κρύο - χρησιμοποιήστε έναν κάδο πάγου

- Εμπειροτεχνική μέθοδος για πόση λύση ο προσωρινός χώρος στη χρήση είναι: 10^5 κύτταρα/uL του προσωρινού χώρου λύσης

- συλλέξτε στους σωλήνες και την ετικέτα eppendorf (κρατήστε αυτών στον πάγο)

Μετρήστε τη συνολική πρωτεΐνη πριν από τη δυτική ανάλυση λεκέδων:

- αυτό επιτρέπει περισσότερη ποσοτική ανάλυση εάν θέλετε να συγκρίνετε τους όρους επεξεργασίας στη δυτική ανάλυση λεκέδων

- οι εμπορικές εξαρτήσεις είναι διαθέσιμες όπως μια δοκιμή του Μπράντφορντ για τη μέτρηση της συνολικής πρωτεΐνης (από το βιο-RAD)

- 0.1% SDS ή μεγαλύτερος μπορεί να παρεμποδίσει την πρωτεϊνική μέτρηση

Μετουσιώστε τα πρωτεϊνικά δείγματα:

- προσθέστε τον πρωτεϊνικό προσωρινό χώρο δειγμάτων φόρτωσης σε ένα υποπολλαπλάσιο του κυττάρου lysate - περιέχει τη χρωστική ουσία (επίσης δείτε τη μετανάστευση σε ένα πήκτωμα, 2% SDS)

- προσθέστε το μειώνοντας πράκτορα δισουλφιδίου όπως βήτα - mercaptoethanol

- Βράστε στο νερό - ομάδα δεδομένων λουτρών ή θέρμανσης (οι χαμηλότερες θερμοκρασίες όπως οι βαθμοί του μέσου της δεκαετίας του 90 μειώνουν την πρωτεϊνική συνάθροιση).

- Σπρώξτε μια τρύπα στην ΚΑΠ κάθε σωλήνα για να αποτρέψετε το σκάσιμο

Sds-ΣΕΛΙΔΑ τα πηκτώματα είναι μήτρες πηκτωμάτων που χρησιμοποιούνται στις χωριστές πρωτεΐνες από το μέγεθος παρουσία του ηλεκτρικού ρεύματος. Το χαμηλό ποσοστό πήζει τις χωριστές μεγαλύτερες πρωτεΐνες ενώ το υψηλότερο ποσοστό πήζει τις χωριστές μικρότερες πρωτεΐνες καλύτερα. Το πρόβλημα είναι ότι όλες οι πρωτεΐνες έχουν χρεωμένη συνδεμένος με τους, και σε ένα ηλεκτρικό ρεύμα αυτό θα μπορούσε να προκαλέσει τα προβλήματα. Αυτό λύνεται από την προσθήκη SDS στα πρωτεϊνικά δείγματα. SDS δεσμεύει στις πρωτεΐνες κάθε λίγα αμινοξέα και εξουδετερώνει τις διαφορές δαπανών που οι πρωτεΐνες έχουν. Αυτό επιτρέπει στις πρωτεΐνες για να χωριστεί από το μέγεθος και όχι από τη δαπάνη.

- ανάλογα με πόση πρωτεΐνη θα θελήσετε να φορτώσετε για το δυτικό λέκιασμα, πρέπει να χρησιμοποιήσετε τις μικρές χτένες ή τις μεγαλύτερες χτένες.

- το ποσοστό της ακρυλαμίδης είναι σημαντικό. Συνήθως η ακρυλαμίδη 10% χρησιμοποιείται.

- Ένα πήκτωμα επίλυσης χρησιμοποιείται στο κατώτατο σημείο με ένα pH 8.8

- Ένα πήκτωμα συσσώρευσης (4-5%) pH 6.8 χρησιμοποιείται για να συσκευάσει τις πρωτεΐνες μέσα μαζί μετά από τη φόρτωση

- Ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων αυξάνεται από τους καταλύτες APS και TEMED που επιταχύνουν την αντίδραση πολυμερισμού (σχηματισμός και στερεοποίηση) του poly-acrylamide πηκτώματος.

- Φορτώστε κάθε δείγμα προσεκτικά και αργά για να αποτρέψετε το δείγμα από την πάροδο.

- Φορτώστε κάθε πάροδο και προσωρινό χώρο δειγμάτων χρήσης σε κάθε ένας (για να αποτρέψει τις διαφορές μέσα).

1. Υποβάλτε τα δείγματα σε φυγοκέντρωση για 10 SEC μετά από να βράσει.
2. Φορτώστε το δείγμα σε κάθε πάροδο
3. Φορτώστε την αναφορά MW
4. Τρέξτε το πήκτωμα 100V (σταθερή τάση) ή ακόμα και καλύτερος σε 40 μΑ (σταθερό ρεύμα). Προσέξτε το πρωτεϊνικό μέτωπο δεικτών/σκαλών ή χρωστικών ουσιών για πότε για να σταματήσει το πήκτωμα. Το σταθερό ρεύμα δίνει τα καλύτερα και αιχμηρότερα αποτελέσματα εάν έχετε το χρόνο.

- ρολόι για τις φυσαλίδες μεταξύ του γυαλιού και κάτω από το πήκτωμα - αυτό σημαίνει ότι λειτουργεί

- ρολόι για την πρωτεϊνική μετανάστευση (πρέπει να πάει κάτω) - εάν όχι έχετε μεταστρέψει τους μολύβδους και μπορείτε να χάσετε όλα τα δείγματά σας!

- Αρχικά τρέξτε αργά μέσω του πηκτώματος συσσώρευσης (~ 50 βολτ), αυτό δίνει τις αιχμηρότερες ζώνες.

- Μην τρέξτε ολονυκτίς

- Μην υπερθερμάνετε το πήκτωμα (αυτό αναγκάζει το πήκτωμα για να χάσει την ακαμψία, που οδηγεί φτωχό και τις μουτζουρωμένες άσχημα διαμορφωμένες ζώνες)

Επιλέξτε τον τύπο μεμβρανών:

Μπορέστε να χρησιμοποιήσει καθένας:

- Μεμβράνη PVDF για τους δυτικούς λεκέδες

- Nitrocellulose μεμβράνη για τους δυτικούς λεκέδες

- Νάυλον μεμβράνη (σπάνια χρησιμοποιούμενη τώρα - μπορεί να σχίσει)

Άκρες για τη μεταφορά στη δυτική μεμβράνη:

- Γάντια ένδυσης πάντα! Λαβίδες χρήσης

- Ελαχιστοποιήστε σχετικά με/λαβίδες στη μεμβράνη

Βιο-RAD κατάταξης μεταφοράς:

(-)
σφουγγάρι στο Μαύρο
έγγραφο φίλτρων
nitrocellulose πηκτωμάτων
έγγραφο φίλτρων
σφουγγάρι
(+)

Μεταφορά:

- Κρατήστε δροσερός 4C

- Μεταφορά ολονυκτίς σε 35 Β

- Μπορεί να μεταφέρει γρήγορα σε 1 ώρα στο υψηλότερο Β

Το φράξιμο μεμβρανών επιτρέπει σε σας για να μεγιστοποιήσει το σήμα: αναλογία θορύβου

- γάντια ένδυσης

- Ομάδα δεδομένων με 5% Blotto (non-fat ξηρό γάλα - σκόνη) ή 1 - 5% BSA (λευκωματίνη βοοειδών ορών) για τις phosphorylated πρωτεΐνες.

- Ο προσωρινός χώρος είναι TBST

Πλύσιμο μετά από να εμποδίσει

- η πλύση μετά από να εμποδίσει τα βήματα δεν είναι κρίσιμη, ως ομάδα δεδομένων ανθρώπων συχνά κατά τη διάρκεια των αρχικών επωάσεων αντισωμάτων.

- η πλύση γίνεται συνήθως με τον προσωρινό χώρο TBST. Μπορέστε να γίνετε γρήγορα με μια μεγάλη ένταση του ήχου TBST.

Επώαση με το αρχικό αντίσωμα

- ποντίκι, κουνέλι ή άλλα είδη

- συνήθως 1: διάλυση 1000 με TBST

- εάν το υψηλό υπόβαθρο/πολλές μη συγκεκριμένες ζώνες είναι ένα πρόβλημα, οι επωάσεις μπορούν να γίνουν με 5% BSA ή γάλα.

Πλύσιμο μετά από το αρχικό αντίσωμα

- όχι τόσο κρίσιμος

- μπορεί να πλύνει γρήγορα με τις μεγάλες εντάσεις του ήχου TBST

Επώαση του δευτεροβάθμιου αντισώματος

- συνήθως αραιωμένο 1: 10, 000 με TBST

- αντι-ποντίκι, αντι-κουνέλι, ή άλλο αντίσωμα που κλίνεται με το ένζυμο HRP για την ανίχνευση

Πλύσιμο μετά από το δευτεροβάθμιο αντίσωμα

- ΚΡΙΣΙΜΟΣ

- Πλύσιμο 5 Χ για 5 λεπτά με TBST.

- Εάν πρέπει πραγματικά να ορμήξετε, πλύντε τουλάχιστον 3 φορές με τις μεγαλύτερες εντάσεις του ήχου TBST.

Να δοκιμάσει για τα αποτελέσματα

- συνήθως ECL (ενισχυμένο Chemiluminescence) χρησιμοποιείται

- η ταινία εκτίθεται και αναπτύσσεται. Η έκθεση για 10 δευτερόλεπτα είναι αρκετά συνήθως για τη συνολική πρωτεΐνη. Phospho-proteins μπορούν να απαιτήσουν 2 - 20 μικρές εκθέσεις.

- η ταινία είναι συνήθως XOMAT ή παρόμοια «γρήγορη» ταινία

WB - δυτικός λεκές

IB - immunoblot (ένας άλλος όρος για το δυτικό λέκιασμα)

SDS - Dodecyl θειικό άλας νατρίου (ένα απορρυπαντικό που χρησιμοποιείται σε πολλές δυτικές λεκιάζοντας λύσεις)

ΣΕΛΙΔΑ - ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων Polyacrilamide

Αβ - αντίσωμα (τα αντισώματα χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν την πρωτεΐνη ενδιαφέροντός σας)

HRP - Peroxidase ραδικιών αλόγων

Luminol - υπόστρωμα που HRP διασπά για να προκαλέσει τον ελαφρύ σχηματισμό

ECL - ενισχυμένο Chemiluminescence (δυτική λύση λεκέδων που ενισχύει τον ελαφρύ σχηματισμό από HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (ο περισσότερος μέσος όρος πρωτεϊνών μεταξύ kDa 30 - 80)

RAM - αντι-ποντίκι Ig κουνελιών

Ig - ανοσοσφαιρίνη (isotype αντισωμάτων)

NP-40 - Nonidet π-40

PMSF - φθορίδιο phenylmethylsulfonyl

BSA - λευκωματίνη βοοειδών ορών

NFDM - Non-fat ξηρό γάλα