Βιοπληροφορική, πρωτόκολλα, RNA πρωτεϊνικό Proteomics DNA

σπίτι > πρωτεϊ'νη > ανιχνεύω λάθη-δυτικός-λεκέδες > index.php

Ανιχνευώντας λάθη δυτικοί λεκέδες

  Ο μοριακός οδηγός σταθμών για τα δυτικές λεκιάζοντας προβλήματα και τις λύσεις: Κοινές δυτικές προβλήματα και λύσεις λεκέδων για τους!

Παρακαλώ μας ελάτε σε επαφή με με τις ιδέες σας εάν μπορείτε να προσθέσετε σε αυτόν τον οδηγό.

 

Ποιο είναι το δυτικό πρόβλημα λεκέδων σας; - Οργανωμένος αλφαβητικά

Συγκεχυμένες ζώνες

Χαμηλό σήμα

Η μεμβράνη καίγεται στο σκοτεινό δωμάτιο

Υψηλό υπόβαθρο

Σημεία στην ταινία

Πάρα πολλές ζώνες στο δυτικό λεκέ

Αδύνατο σήμα

 

 

Πρόβλημα λεκέδων ανίχνευσης λαθών δυτικό:

Σημεία στην ταινία (ελλείπουσες ζώνες) :

- Φτωχή μεταφορά λόγω στις αεροφυσαλίδες κατά τη διάρκεια της μεταφοράς στη μεμβράνη

- βρώμικη ταινία κατά το προσθήκη στον υπεύθυνο για την ανάπτυξη

- οι ρόλοι υπεύθυνων για την ανάπτυξη είναι βρώμικοι

Λύση στα σημεία στην ταινία:

- χρησιμοποιήστε ένα σιφώνιο pasteur ως ρόλο κυλίνδρων η μεμβράνη και πήξτε προτού να κρατήσει η μεταφορά για να αφαιρέσει τις φυσαλίδες τη μεμβράνη και τα υλικά υγρές.

- κρατήστε την ταινία καθαρή πρίν προσθέτει στον υπεύθυνο για την ανάπτυξη

 

Πρόβλημα λεκέδων ανίχνευσης λαθών δυτικό:

Πάρα πολλές ζώνες στο δυτικό λεκέ:

- συνήθως λόγω σε πολλές μη συγκεκριμένες ζώνες

- κακή αρχική ποιότητα αντισωμάτων ή παλαιό αντίσωμα

- αρκετά εμποδίζοντας όχι

- proteolytic σχίσιμο του αντιγόνου - όλες οι πρόσθετες ζώνες είναι χαμηλότερο MW από την πρωτεϊ'νη σας, (δηλ. η πρωτεϊ'νη σας ανιχνεύεται αλλά υποβιβάστηκε)

Λύσεις σε πάρα πολλές ζώνες στο δυτικό λεκέ:

- αγοράστε ένα άλλο αντίσωμα ή αντικαταστήστε με ένα φρέσκο απόθεμα αντισωμάτων

- η ομάδα δεδομένων με 5% ξεραίνει το non-fat γάλα ή BSA πριν από την προσθήκη αρχική. Εάν εμποδίζετε ήδη, θεωρήστε κατά τη διάρκεια των αρχικών και δευτεροβάθμιων επωάσεων αντισωμάτων και του επίσης αυξανόμενου εμποδίζοντας γάλακτος ή της συγκέντρωσης BSA.

- κρατήστε όλα στον πάγο, χρησιμοποιήστε τα φρέσκα δείγματα, κατάστημα μέσα - 80C, και ανασταλτικοί παράγοντες πρωτεάσεων χρήσης όπως PMSF

 

Πρόβλημα λεκέδων ανίχνευσης λαθών δυτικό:

Υψηλό υπόβαθρο χαμηλή αναλογία σήματος/διαταραχή στο δυτικό λεκέ

- ο Μαύρος ή κάθε μελαχροινή ταινία η ταινία εκτέθηκε πάρα πολύ πολύ

- το φράξιμο ήταν ανεπαρκές ο μη συγκεκριμένος συσχετισμός του αρχικού αντισώματος και τα δευτεροβάθμια αντισώματα δεν πλύθηκαν εντελώς

- η πλύση ήταν ανεπαρκής

- πυρακτώσεις ταινιών στο σκοτάδϊ - πάρα πολύ υψηλές δευτεροβάθμιες ή αρχικές διαλύσεις

Λύσεις στη σκοτεινή ταινία:

- εκθέστε για το λιγότερο χρόνο, μειώνει το χρόνο έκθεσης

- αυξήστε τη "διάρκεια" φραξίματος του non-fat ξηρού γάλακτος 5% επώαση ή αυξήστε τη συγκέντρωση.

- επίσης μπορείτε να προσπαθήσετε με ολόκληρο τον ορό του ζώου ξένιου χ/υ με (ή πριν) το δευτεροβάθμιο αντίσωμα

- χρόνοι και εντάσεις του ήχου πλύσης αύξησης να βοηθήσει να αφαιρέσει οποιοδήποτε μη συγκεκριμένο σήμα λόγω στον αδύνατο συσχετισμό αντισωμάτων.

- χρησιμοποιώντας ένα ισχυρότερο απορρυπαντικό που πλένει - αντί TBST (τωεεν-20), που χρησιμοποιεί τα ισχυρότερα απορρυπαντικά όπως NP- 40 ή SDS που μπορούν να παρέχουν ένα πιό αυστηρό πλύσιμο και να μειώσουν το υπόβαθρο (κάνετε αυτό μόνο εάν ενώνετε είστε ισχυροΐ - η πλύση αφαιρεί επίσης κάποια ζώνη ενδιαφέροντός σας!)

- πολύ υψηλή δευτεροβάθμια συγκέντρωση αντισωμάτων (ή ακόμα και αρχικός) - εκτελέστε τα πειράματα βελτιστοποίησης για να καθορίσετε ότι οι κατάλληλες διαλύσεις αντισωμάτων αραιώνουν τα αντισώματα περαιτέρω.

 

Πρόβλημα λεκέδων ανίχνευσης λαθών δυτικό:

Χαμηλό σήμα ή αδύνατο σήμα

- λόγω όχι σε αρκετή πρωτεϊ'νη που φορτώνεται στο πήκτωμα

- το αρχικό αντίσωμα είναι παλαιό ή μη καλό

- phospho-proteins χρειάζονται συνήθως την ολονύκτια αρχική επώαση αντισωμάτων

- όχι αρκετό δευτεροβάθμιο αντίσωμα

- πέρα από-φράξιμο

- αναπτυσσόμενα τα αντιδραστήρια είναι κακά/εσείς έκαναν ένα λάθος κατά την προετοιμασία τους

Λύσεις στο χαμηλό σήμα ή το αδύνατο σήμα:

- φορτώστε το πιό πρωτεϊνικό δείγμα επάνω στο πήκτωμα

- δοκιμάστε το φρέσκο αρχικό αντίσωμα

- επωάστε το αρχικό αντίσωμα overnite για phosphoproteins σε 4 βαθμούς γ (δονητής κρύων δωματίων)

- αυξήστε τη συγκέντρωση της πρωτεϊ'νης (lyse τα δείγματα στο λιγότερο προσωρινό χώρο λύσης)

- μειώστε τη συγκέντρωση του εμποδίζοντας πράκτορα

- ελέγξτε τα αναπτυσσόμενα αντιδραστήρια προετοιμάστε φρέσκα ECL και επαν- ecl η μεμβράνη

- αυξήστε τη συγκέντρωση ή το μήκος της αρχικής περιόδου επώασης αντισωμάτων

- αυξήστε τη συγκέντρωση ή το μήκος της δευτεροβάθμιας περιόδου επώασης αντισωμάτων

 

Συγκεχυμένες ζώνες, ζώνες που λερώνονται, ζώνες μη αιχμηρές

- ζώνες που λερώνονται λόγω στο καυτό πήκτωμα

- ζώνες συγκεχυμένες λόγω στην υψηλή τάση

Λύσεις στις συγκεχυμένες ζώνες και τις Η.Ε-αιχμηρές ζώνες:

- η τάση μείωσης ή το ρεύμα, τρέξιμο στο κρύο δωμάτιο, και προετοιμάζει το νέο τρέχοντας προσωρινό χώρο (αιτίες θερμότητας το πήκτωμα για να χάσει την ακαμψία του και την επιλύοντας δύναμή του)

- προ-ενυδατώστε τη μεμβράνη μεταφοράς στην κατάλληλη λύση μεταφοράς (που καθορίζεται από τον κατασκευαστή μεμβρανών) για το απαραίτητο χρονικό διάστημα.