Η μοριακή βιολογία Blog


Immunoprecipitation πρωτόκολλα	Immunoprecipitation κατάλογος αρχείων πρωτοκόλλου (εξωτερικές συνδέσεις)	Ανιχνευήστε λάθη immunoprecipitation	Μάθετε για immunoprecipitation

Immunoprecipitation πρωτόκολλα

Immunoprecipitation κατάλογος αρχείων πρωτοκόλλου (εξωτερικές συνδέσεις)

Ανιχνευήστε λάθη immunoprecipitation

Μάθετε για immunoprecipitation

Πρωτεϊνικός καθαρισμός

Μοριακός σταθμός πνευματικών δικαιωμάτων 2006

Ο πρωτεϊνικός καθαρισμός είναι ζωτικής σημασίας στο χαρακτηρισμό της πρωτεϊ'νης ενδιαφέροντός σας. Ο καθαρισμός της πρωτεϊ'νης σας επιτρέπει σε μιας για να μελετήσει τη λειτουργία της πρωτεϊ'νης, και την ενζυματική δραστηριότητά του. Οι πληροφορίες Stuctural από την πρωτεϊ'νη μπορούν επίσης να ληφθούν από τις καθαρισμένες πρωτεϊ'νες συμπεριλαμβανομένων των NMR, τρισδιάστατων πληροφοριών όπως η πρωτεϊνική κρυστάλλωση.

Τόσο πώς το ένα πηγαίνει για τον καθαρισμό μιας πρωτεϊ'νης;

Οι πρωτεϊ'νες μπορούν να καθαριστούν σύμφωνα με το μέγεθος, τη διαλυτότητα, τη δαπάνη και τη δεσμευτική συγγένεια

Οι πρωτεϊ'νες μπορούν εύκολα να απεικονιστούν και να διαφοροποιηθούν με τις μεθόδους ηλεκτροφόρησης. Οι τεχνικές πηκτωμάτων διατριβών μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για να λάβουν τις μικρές ποσότητες (μικρογραμμάρια) καθαρισμένα polypeptides. Εντούτοις, δεν παρέχουν τις μεγάλες ποσότητες των καθαρισμένων πρωτεϊνών στο εγγενές κράτος τους. Οι ουσιαστικές ποσότητες καθαρισμένων πρωτεϊνών, της τάξης των πολλών χιλιοστογράμμων, απαιτούνται για να διευκρινίσουν πλήρως την τρισδιάστατη δομή τους και το μηχανισμό ενέργειάς τους. Αρκετές χιλιάες πρωτεϊ'νες έχουν καθαριστεί με ενεργό μορφή βάσει τέτοιων χαρακτηριστικών όπως το μέγεθος, τη διαλυτότητα, τη δαπάνη και τη συγκεκριμένη δεσμευτική συγγένεια. Σε κάθε βήμα στον καθαρισμό, η προετοιμασία δοκιμάζεται για μια διακριτική ιδιοκτησία της πρωτεϊ'νης ενδιαφέροντος (π.χ. ενζυματική δραστηριότητα) να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας.

Οι πρωτεϊ'νες μπορούν να χωριστούν από τα μικρά μόρια από τη διάλυση μέσω μιας semi-permeable μεμβράνης, όπως η μεμβράνη κυτταρίνης με τους πόρους. Τα μόρια που έχουν τις διαστάσεις σημαντικά μεγαλύτερες από τη διάμετρο πόρων διατηρούνται μέσα στην τσάντα διάλυσης, τα μικρότερα μόρια και τα ιόντα wwhereas διαπερνούν τους πόρους μιας τέτοιας μεμβράνης και προκύπτουν στη διάλυση έξω από την τσάντα.

Περισσότερος διακριτικός χωρισμός βάσει του μεγέθους μπορεί να επιτευχθεί από την τεχνική χρωματογραφίας πήκτωμα-διήθησης. Το δείγμα εφαρμόζεται στην κορυφή της στήλης που αποτελείται από τις πορώδεις χάντρες φιαγμένες από αδιάλυτο αλλά ιδιαίτερα ενυδατωμένο πολυμερές σώμα όπως dextran ή το αγαρόζη (που είναι υδατάνθρακες) ή polyacrylamide. Sephadex, sepharose, και bio-gel είναι συνήθως χρησιμοποιημένες εμπορικές προετοιμασίες αυτών των χαντρών, οι οποίες είναι χαρακτηριστικά 100 μικρόμετρα στη διάμετρο. Τα μικρά μόρια μπορούν να εισαγάγουν αυτές τις χάντρες αλλά μεγάλοι δεν μπορούν. Το αποτέλεσμα είναι ότι τα μικρά μόρια διανέμονται και στο διάλυμα ύδατος μέσα στις χάντρες και μεταξύ τους, ενώ τα μεγάλα μόρια βρίσκονται μόνο στη λύση μεταξύ των χαντρών. Τα μεγάλα μόρια διατρέχουν γρηγορότερα αυτής της στήλης και προκύπτουν πρώτα, επειδή μια μικρότερη ένταση του ήχου είναι προσιτή σε τα. Πρέπει να σημειωθεί ότι η κατάταξη της εμφάνισης των μορίων από μια στήλη των πορωδών χαντρών είναι η αντιστροφή της κατάταξης στην ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων, στην οποία ένα συνεχές πολυμερές πλαίσιο εμποδίζει τη μετακίνηση των μεγάλων μορίων. Οι πολύ μεγαλύτερες ποσότητες πρωτεϊ'νης μπορούν να χωριστούν από τη χρωματογραφία διήθησης πηκτωμάτων απ'ό,τι από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων αλλά στην τιμή του χαμηλότερου ψηφίσματος.

Τη διαλυτότητα των περισσότερων πρωτεϊνών χαμηλώνουν στις υψηλές αλατισμένες συγκεντρώσεις. Αυτή η επίδραση, αποκαλούμενη αλατίζοντας έξω, είναι πολύ χρήσιμη, αν και κατανοητή όχι καλά. Η εξάρτηση της διαλυτότητας στην αλατισμένη συγκέντρωση διαφέρει από μια πρωτεϊ'νη σε άλλη. Ως εκ τούτου να αλατίσει μπορεί έξω να χρησιμοποιηθεί για να διαχωρίσει σε συστατικά τις πρωτεϊ'νες. Να αλατίσει είναι έξω επίσης χρήσιμο για τις αραιές λύσεις των πρωτεϊνών.