Ο χορηγός/διαφημίζει & Σύνδεση με μας & Μας ελάτε σε επαφή με & Περίπου εμείς & Μας βοηθήστε

Η μοριακή βιολογία Blog

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Immunoprecipitation

Immunoprecipitation είναι μια τεχνική που χρησιμοποιεί τα αντισώματα συγκεκριμένα για μια πρωτεϊ'νη για να αφαιρέσει εκείνες τις πρωτεϊ'νες από τη λύση. Τα αντίσωμα-πρωτεϊνικά συγκροτήματα κατακρημνίζονται από τη λύση με την προσθήκη μιας αδιάλυτης μορφής των δεσμευτικών πρωτεϊνών αντισωμάτων. Τα παραδείγματα περιλαμβάνουν το πρωτεϊνικό Α, το πρωτεϊνικό γ, Zysorbin, Immunoprecipitin, ή την προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος στη λύση (δείτε το διάγραμμα 1 κατωτέρω).

Immunoprecipitation πίνακας του περιεχομένου

1. Immunoprecipitation υπόβαθρο
2. Immunoprecipitation προσωρινοί χώροι
3. Πρόσφατα immunoprecipitation θέματα
4. Immunoprecipitation πρωτόκολλα
5. Immunoprecipitation ενημερωτικό δελτίο
6. Immunoprecipitation άρθρα
7. Immunoprecipitation ανίχνευση λαθών

Διάγραμμα 1.

Τα δείγματα μπορούν έπειτα να πλυθούν μετά από την πτώση και τη φυγοκεντρικότητα. Τα ιζήματα μπορούν έπειτα να οργανωθούν στα πηκτώματα σδς-ΣΕΛΙΔΩΝ με τον πρωτεϊνικό προσωρινό χώρο δειγμάτων. Συνήθως τα πρωτεϊνικά δείγματα είναι ραδιενεργά πριν από τη λύση κυττάρων. Αυτό γίνεται με συνήθως να προσθέσει τα ραδιενεργά αμινοξέα στα κύτταρα. Αυτό καθιστά τα πράγματα απλά όπως η πρωτεϊ'νη έπειτα εύκολα ανιχνεύεται στην ταινία όταν οργανώνεται σε ένα πήκτωμα ως σημείο θα εκπέμψει τη ραδιενέργεια και θα εκθέσει την ταινία. Μπορείτε έπειτα να αξιολογήσετε για το μέγεθος της πρωτεϊ'νης (σε μοριακό βάρος με τη σύγκριση στα πρότυπα μεγέθους), και την ποσότητα (με τη σύγκριση των αντιμετωπισμένων δειγμάτων ή με πρότυπα των ποσοτήτων).

Επιπλέον, η immunoprecipitation διαδικασία επιτρέπει επίσης τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών που δεν είναι πολύ άφθονες ή δύσκολο να ανιχνευθούν τη χρησιμοποίηση του δυτικού λεκέ. Η IP μπορεί να συγκεντρώσει τις πρωτεϊ'νες μέχρι τις 10.000-πτυχές δεδομένου ότι μπορεί να πάρει τις μεγάλες εντάσεις του ήχου του κυττάρου lysates και να συγκεντρώσει την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας σε ένα μικρό ίζημα που μπορεί έπειτα να χρησιμοποιηθεί για τη δυτική ανάλυση λεκέδων ή άλλες μεθόδους.

 

Εφαρμογές immunoprecipitation:

1) Ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους και της ποσότητας η πρωτεϊ'νη από SDS-PAGE.

2) Immunoprecipitation χρησιμοποιείται για να αξιολογήσει για τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Αυτό γίνεται με immunoprecipitation για μια πρωτεϊ'νη, και έπειτα το λέκιασμα για μια άλλη πρωτεϊ'νη.

3) Προσδιορισμός της ποσότητας του ποσοστού σύνθεσης μιας πρωτεϊ'νης στα κύτταρα με τον καθορισμό της ραδιενεργού πρωτεϊ'νης ποσότητας που γίνεται κατά τη διάρκεια ενός συγκεκριμένου χρονικού διαστήματος.

4) Immunoprecipitation επιτρέπει στη συγκέντρωση των πρωτεϊνών που είναι ειδάλλως δύσκολο να ανιχνευθούν.

 

Η immunoprecipitation μέθοδος μπορεί να διαιρεθεί σε διάφορα βήματα:

1. Προετοιμασία δειγμάτων και λύση κυττάρων
2. Preclearing της λύσης
3. Επώαση με το αντίσωμα και σχηματισμός των συγκροτημάτων αντίσωμα-αντιγόνων
4. Πτώση του συγκροτήματος ενδιαφέροντος
5. Πλύση των συγκροτημάτων αντίσωμα-αντιγόνων για να αφαιρέσει τις μη συγκεκριμένους πρωτεϊ'νες και τους μολυσματικούς παράγοντες.
6. Ανάλυση των συγκροτημάτων/αντιγόνο ενδιαφέροντος από SDS-PAGE

Immunoprecipitation πρωτόκολλα	Immunoprecipitation κατάλογος αρχείων πρωτοκόλλου (εξωτερικές συνδέσεις)	Ανιχνευήστε λάθη immunoprecipitation	Μάθετε για immunoprecipitation

Immunoprecipitation προετοιμασία δειγμάτων και λύση κυττάρων

 

Immunoprecipitation προσωρινοί χώροι λύσης

Ανάλογα με την εφαρμογή immunoprecipitation ή της IP, θα θελήσετε να χρησιμοποιήσετε τους διαφορετικούς προσωρινούς χώρους λύσης.  Η επιλογή του προσωρινού χώρου λύσης είναι σημαντική και εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά της πρωτεϊ'νης ενδιαφέροντος.

Εάν δοκίμαζε η ανάγκη phosphorylation μελέτης των πρωτεϊνών ή των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνικός-πρωτεϊ'νης, εσείς NP- 40.

Εάν μελετάτε τα επίπεδα συνολικής πρωτεϊ'νης μιας πρωτεϊ'νης, πρέπει να δοκιμάσετε RIPA.

Ο προσωρινός χώρος RIPA δίνει το χαμηλότερο υπόβαθρο immunoprecipitation. Εντούτοις, RIPA μπορεί να μετουσιώσει μερικές πρωτεϊ'νες. Εάν πραγματοποιείτε immunoprecipitation τα πειράματα στις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις μελέτης, RIPA δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί δεδομένου ότι μπορεί να αναστατώσει τις αλληλεπιδράσεις protein:protein.

NP- 40 ο προσωρινός χώρος έχει ένα χαμηλότερο deanturing επίπεδο, και χρησιμοποιείται έτσι για phosphorylation τα πειράματα όπως η εξέταση τη δραστηριότητα κινάσεων. Επίσης NP- 40 χρησιμοποιούνται για τις πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. NP40 είναι ένα μη ιοντικό απορρυπαντικό, και είναι το ο συνηθέστερα χρησιμοποιημένο απορρυπαντικό στους προσωρινούς χώρους λύσης κυττάρων για immunoprecipitation και το δυτικό λεκέ.

Προσωρινός χώρος λύσης κυττάρων RIPA - immunoprecipitation συνταγή προσωρινών χώρων

• 50 mM τρης- HCl
• Προσαρμοστείτε στο pH 7,4
• 150 mM NaCl
• 1 mM PMSF
• 1 mM EDTA
• 5 ΅g/mjl. Aprotinin
• 5 ΅g/mjl. Leupeptin
• 1% triton Χ- 100
• Deoxycholate νατρίου 1%
• 0,1% SDS

NP- 40 προσωρινός χώρος λύσης κυττάρων - immunoprecipitation συνταγή προσωρινών χώρων

• 50 mM τελική συγκέντρωση τρης- HCl
• 150 mM τελική συγκέντρωση NaCl
• Προσθέστε 1% NP- 40
• Προσαρμοστείτε στο pH 8,0

Προ-καθαρισμός για immunoprecipitation

Το preclear βήμα γίνεται συνήθως για immunoprecipitation επειδή χαμηλώνει την ποσότητα των μη συγκεκριμένων πρωτεϊνών στο κύτταρο lysate. Επιπλέον, ο προ-καθαρισμός αφαιρεί επίσης τις πρωτεϊ'νες που μπορούν να έχουν τις πιθανές μη συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις και μια υψηλή συγγένεια για το πρωτεϊνικό Α, πρωτεϊνικό γ, Immunoprecipitin, Zysorbin, ή ο,τιδήποτε αδιάλυτη μορφή της δεσμευτικής πρωτεϊ'νης αντισωμάτων χρησιμοποιείτε pull-down το αντίσωμά σασ. Μερικοί ερευνητές βρίσκουν αυτό το βήμα περιττό και πηδούν αυτό το βήμα. Προσπαθήστε προ- τον πρώτο χρόνο που δοκιμάζετε immunoprecipitation. Εάν τα αποτελέσματά σας είναι αρκετά σαφή, προσπαθήστε το επόμενο πείραμα προ-καθαρισμού και δείτε πώς βγάζει.

 

IP: Αντίσωμα επώασης και σχηματισμός των συγκροτημάτων αντίσωμα-αντιγόνων

Ποιο αντίσωμα θα έπρεπε να χρησιμοποιήσετε για immunoprecipitation; Συνήθως τα polyclonal αντισώματα χρησιμοποιούνται για το immunoprecipation.

 

Immunoprecipitation - πτώση του συγκροτήματος ενδιαφέροντος

Τα συγκροτήματα αντίσωμα-αντιγόνων δεν είναι αδιάλυτα μόνοι τους, δηλ. immunoprecipitation, δεν είναι μια πλήρης ιδέα. Τα αντισώματα και ο συσχετισμός τους στα αντιγόνα είναι διαλυτοί στο αίμα, προσωρινοί χώροι, και κατά τη διάρκεια του immunoprecipitation πειράματος.  Αυτό που χρησιμοποιείται για να κατακρημνίσει έξω αυτά τα συγκροτήματα είναι αδιάλυτες δεσμευτικές πρωτεϊ'νες αντισωμάτων. Οι πρωτεϊ'νες Α και γ, απομονώθηκαν από τα βακτηρίδια, και δεσμεύουν στη σταθερή περιοχή του αντισώματος.

Τα παραδείγματα των αδιάλυτων δεσμευτικών πρωτεϊνών αντισωμάτων που χρησιμοποιούνται στα συγκροτήματα ιζήματος immunoprecipitation είναι:

• Πρωτεϊνικό Α
• Πρωτεϊνικό γ
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Immunoprecipitation - βήματα πλύσης

  Το πλύσιμο των συγκροτημάτων γίνεται χρησιμοποιώντας RIPA, PBS, τον προσωρινό χώρο IP-PLYSJ'MATOS, ή άλλους προσωρινούς χώρους ανάλογα με αυτό που θα επιθυμούσατε να αναλύσετε μετά από την IP. Ο προσωρινός χώρος RIPA είναι πιό αυστηρός ενώ PBS είναι λιγότερο αυστηρό.

Συνταγή προσωρινών χώρων πλυσίματος IP

• 10mM Tris Προσαρμοστείτε στο pH 7,4
• EDTA 1mM
• 1mM EGTA pH 8,0
• 150mM NaCl
• 1% triton Χ- 100
• νάτριο 0.2mM ορθο -ορθο-βαναδατε
• κοκτέιλ ανασταλτικών παραγόντων πρωτεάσεων

 

Τελικές σημειώσεις για immunoprecipitation

  Immunoprecipitation η επιτυχία εξαρτάται από τη συγγένεια του αντισώματος για το αντιγόνο της.  Ένα καλό immunoprecipitation αντίσωμα θα σας δώσει το χαμηλό υπόβαθρο όταν αναλύετε τα δείγματα χρησιμοποιώντας άλλες τεχνικές μετά από την IP.  Οι αδιάλυτες αντίσωμα-δεσμευτικές πρωτεϊ'νες χρησιμοποιούμενες είναι επίσης πολύ σημαντικές. Τα polyclonal αντισώματα είναι τα καλύτερα αντισώματα που χρησιμοποιούν εντούτοις τα καθαρισμένα μονοκλονικά αντισώματα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν.  Ελέγξτε τον προμηθευτή αντισωμάτων σας που βλέπει εάν το μονοκλονικό αντίσωμά σας εξετάστηκε για immunoprecipitation.

 

Ακρες για immunoprecipitation

• Η χρήση 2 mL σωλήνες για immunoprecipitation καθώς κατακρημνίζουν πλένεται ευκολότερα και επαναρτείται
• Προσπαθήστε το βήμα προ-καθαρισμού για να κερδίσει χρόνο
• Αντί του πλυσίματος με τον προσωρινό χώρο IP-PLYSJ'MATOS δοκιμάστε PBS
• Εάν έχετε ήδη το χαμηλό υπόβαθρο και το αντίσωμά σας είναι μεγάλο, δοκιμάστε την πλύση IP 2X αντί 5X
• Σιγουρευτείτε ότι αφαιρείτε τόσο υγρό από τους σωλήνες eppendorf όταν immunoprecipitation πλύση

Μοριακός σταθμός πνευματικών δικαιωμάτων 2006-2008