Immunoprecipitation πρωτόκολλο

Immunoprecipitation και πρωτόκολλα.

Βασικό immunoprecipitation πρωτόκολλο IP:

1. Μεταχειριστείτε τα κύτταρά σας

2. Συγκομίστε τα κύτταρα με την προσθήκη 500 uL της διαλυτοποίησης του προσωρινού χώρου, ξύστε και περάστε μέσω της σύριγγας τους χρόνους 21-μετρητών βελόνων X5 να ομογενοποιήσει.

3. Διευθύνετε μια tca πτώση (αυτό θα χρησιμοποιηθεί για να κανονικοποιήσει εάν εσείς ραδιενεργοί τα κύτταρα π.χ. με s- 35)

4. Προ-καθαρίζοντας: Προ-καθαρίστε με την προσθήκη 2 uL του Χ, του ποντικιού ή του κουνελιού ή του ορού αιγών (όπου το Χ είναι το ζωικό είδος στο οποίο το αρχικό αντίσωμα αυξήθηκε) σε ολόκληρα τα δείγματα και επωάζει rotator για 30 λεπτά στη θερμοκρασία δωματίου.

5. Αφαιρέστε τον ορό Χ με την επώαση με uL το immunoprecipitin 30 με την περιστροφή 30 λεπτών στη θερμοκρασία δωματίου.

6. Υποβάλτε τα δείγματα σε φυγοκέντρωση για 3 λεπτά σε 13 ..000 περιστροφές/λεπτό.

7. Μετά από τη φυγοκεντρικότητα, προσθέστε 5 uL του αρχικού αντισώματος (συγκεκριμένη πρωτεϊ'νη Χ αντι-Υ, όπου το Υ είναι το αντίσωμα που αυξάνεται σε ένα ζώο για την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας) στα supernatants και επωάστε ολονυκτίς σε 4 βαθμούς γ.

8. Προσθέστε 100 uL του immunoprecipitin στα δείγματα. Εναλλακτικά μπορείτε να χρησιμοποιήσετε Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin απαιτεί μερικές ελάχιστες αλλαγές στο πρωτόκολλο)

9. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 13 ..000 περιστροφές/λεπτό για 3 λεπτά. Αφαιρέστε το υπερκείμενο νερό.

10. Πλύντε το σβόλο 3 Χ με 1 mL του κρύου προσωρινού χώρου πλυσίματος IP (προσθέστε τους ανασταλτικούς παράγοντες πρωτεάσεων στον προσωρινό χώρο wah πριν από τη χρήση) με το τίναγμα για 5-10 λεπτά μεταξύ κάθε πλυσίματος.

11, Χρησιμοποιήστε αυτόν τον σβόλο που τρέχει σε ένα πήκτωμα σδς-ΣΕΛΙΔΩΝ. Μπορείτε να προσθέσετε τον προσωρινό χώρο δειγμάτων SDS (πρωτεϊνικός προσωρινός χώρος φόρτωσης) στο αυτό το και το φορτίο στο πήκτωμα άμεσα μετά από να βράσετε.

Στείλετε αυτήν την σελίδα σε έναν φίλο

Βιοπληροφορική, πρωτόκολλα, RNA πρωτεϊνικό Proteomics DNA

Ενδοκυτταρικοί σταθμοί

Immunoprecipitation πρωτόκολλο

Βασικό immunoprecipitation πρωτόκολλο IP: