Πρωτεϊνική δοκιμή του Μπράντφορντ

Πρωτεϊνικός προσδιορισμός συγκέντρωσης από τη δοκιμή του Μπράντφορντ

Μια απλή διαδικασία για τον προσδιορισμό της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης στις λύσεις είναι η πρωτεϊνική δοκιμή του Μπράντφορντ που περιγράφηκε πρώτα από το Μπράντφορντ (Μπράντφορντ et Al, 1976).

Μια εκτίμηση της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης είναι ουσιαστική να γίνει γρήγορα και ακριβώς σε πολλά πεδία της πρωτεϊνικής μελέτης. Η δοκιμή του Μπράντφορντ έχει γίνει η συνιστώμενη μέθοδος για την πρωτεϊ'νη σε πολλά εργαστήρια. Αυτή η τεχνική είναι απλούστερη, γρηγορότερα, και πιό ευαίσθητη από τη μέθοδο Lowry. Επιπλέον, σε σύγκριση με τη μέθοδο Lowry, υπόκειται στη λιγότερη παρέμβαση από τα κοινά αντιδραστήρια και τα nonprotein συστατικά των βιολογικών δειγμάτων.

Η δοκιμή του Μπράντφορντ στηρίζεται στο συσχετισμό του μπλε γ- 250 Coomassie χρωστικών ουσιών στην πρωτεϊ'νη.

Οι λεπτομερείς μελέτες δείχνουν ότι η ελεύθερη χρωστική ουσία μπορεί να υπάρξει με τέσσερις διαφορετικές ιοντικές μορφές για τις οποίες οι τιμές pKa είναι 1,15, 1,82, και 12.4. Από τα τρία χρέωσε τις μορφές της χρωστικής ουσίας που υπερισχύουν στην όξινη λύση αντιδραστηρίων δοκιμής, οι πιό κατιονικές κόκκινες και πράσινες μορφές έχουν τα μέγιστα απορροφητικότητας σε 470 NM και 650 NM, αντίστοιχα. Αντίθετα, η πιό ανιονική μπλε μορφή της χρωστικής ουσίας, που δεσμεύει στην πρωτεϊ'νη, έχει ένα μέγιστο απορροφητικότητας σε 590 NM.

Κατά συνέπεια, η ποσότητα πρωτεϊ'νης μπορεί να υπολογιστεί με τον καθορισμό του ποσού χρωστικής ουσίας στην μπλε ιοντική μορφή. Αυτό επιτυγχάνεται συνήθως με τη μέτρηση της απορροφητικότητας της λύσης σε 595 NM.

Η χρωστική ουσία εμφανίζεται να δεσμεύει ο ευκολότερα στο arginyl και τα lysyl υπολείμματα πρωτεϊνών. Αυτή η ιδιομορφία μπορεί να οδηγήσει στην παραλλαγή στην απάντηση της δοκιμής στις διαφορετικές πρωτεϊ'νες, η οποία είναι το βασικό μειονέκτημα της μεθόδου. Η αρχική δοκιμή του Μπράντφορντ εμφανίζει μεγάλη παραλλαγή στην απάντηση μεταξύ των διαφορετικών πρωτεϊνών. Διάφορες τροποποιήσεις στη μέθοδο έχουν αναπτυχθεί για να υπερνικήσουν αυτό το πρόβλημα.

Εντούτοις, αυτές οι αλλαγές οδηγούν γενικά σε μια λιγότερο γερή δοκιμή που είναι συχνά πιό ευαίσθητη στην παρέμβαση από άλλες χημικές ουσίες. Συνεπώς, η αρχική μέθοδος που επινοείται από το Μπράντφορντ παραμένει η καταλληλότερη και ευρέως χρησιμοποιημένη διατύπωση. Δύο τύποι δοκιμών περιγράφονται εδώ: η πρότυπη δοκιμή, που είναι κατάλληλη για μεταξύ 10 και 100 ΅g της πρωτεϊ'νης, και microassay, το οποίο ανιχνεύει μεταξύ 1 και 10 ΅g της πρωτεϊ'νης. Το τελευταίο, αν και πιό ευαίσθητο, είναι επίσης περισσότερη επιρρεπής σε παρέμβαση από άλλες ενώσεις λόγω του μεγαλύτερου ποσού δείγματος σχετικά με το αντιδραστήριο χρωστικών ουσιών με αυτήν την μορφή της δοκιμής.

δείτε επίσης: Πρωτεϊνικό πρωτόκολλο δοκιμής του Μπράντφορντ

Αναφορές μεθόδου του Μπράντφορντ

Μπράντφορντ, πρωκτικό biochem. 72: 248, 1976.

 

Πρωτεϊνικά πρωτόκολλα

Πρωτεϊνική εγκυκλοπαίδεια

Πρωτεϊνική βιοπληροφορική

Πρωτεϊνικό φόρουμ επιστήμης

Πρωτεϊνικό Blog

Ειδήσεις DNA